鐵蛋白免疫電鏡技術是以鐵蛋白標記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。
基本介紹
- 中文名：鐵蛋白免疫電鏡技術
- 外文名：鐵蛋白免疫電鏡技術
- 性質：標記抗體，抗體與待檢抗原作用。
- 提取：鐵蛋白－抗體交聯法
材料與試劑,操作方法,鐵蛋白的提取,鐵蛋白－抗體交聯法,鐵蛋白－抗體結合物處理標本,結果判定,
材料與試劑
1．馬脾鐵蛋白
2．硫酸銨
3．硫酸鎘
4．雙異氰酸鎘二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩衝液將XC配製成1%溶液。注意配製的水及容器必須特別清潔，配製後放置4℃數天，以不出現沉澱為準。如出現沉澱XC的多聚體形成，應重配。
5．0.30Mol/L pH 9.5硼鹽酸緩衝液
6．0.1Mol/L硫酸銨液
7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液
操作方法
鐵蛋白的提取
⑴ 配製2%硫酸銨液，並以1Mol/L的NaOH或HCl調pH值，正好為5.85。取1g鐵蛋白溶於100ml的2%硫酸銨液中。
⑵ 加入20%硫酸鎘，使最終濃度為5%，混勻，4℃過夜。
⑶ 1 500g離心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸銨至100ml，混勻，離心，去除不純沉渣。
⑷ 於上清液中重新加入20%硫酸鎘，重複步驟⑵，離心，去上清。
⑸ 檢查沉渣，置顯微鏡下檢查，應具有典型的黃褐色結晶，結晶為六角形，雙一四點結構，如結晶不典型，應繼續重複以上步驟。
⑹ 以少量的蒸餾水溶解，再加50%飽和硫酸銨溶液，使之沉澱，離心，去上清。
⑺ 重複步驟⑹一次。
⑻ 以少量蒸餾水溶解,常水透析24h後,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min離心2h，去除上部無色上清液(約3/4總量)，置4℃過夜。
⑽ 用微孔濾膜(孔徑0.45μ)過濾，使鐵蛋白含量為65mg/ml～75mg/ml，分裝，4℃保存不要凍乾保存,以免鐵蛋白結構遭破壞。
鐵蛋白－抗體交聯法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩衝液將鐵蛋白稀釋成20mg/ml～25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室溫攪拌45min，離心去沉澱。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩衝液將提純lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白－XC液，4℃攪拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸銨溶液透析過夜，以除去多餘的異氰酸鹽，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢復到生理水平。
⑸ 超速離心 以1.00×105g離心5h，去上清，沉澱以0.05Mol/L PBS懸浮，再次離心，以除去未結合的IgG。
⑹ 以血清學及免疫學方法測定結合抗體的特異性、免疫活性以及標記效應，如果操作步驟嚴格，結果是滿意的。
鐵蛋白－抗體結合物處理標本
（1）將標本以5%福馬林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。
（2）用冷的PBS液洗滌，離心。
（3）如是組織塊，則在解剖顯微鏡下切成更小塊，放入試管中，加入鐵蛋白－抗體結合物置室溫20min，不時振盪,
（4）以冷PBS液洗滌三次，離心。
（5）沉澱以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗滌。
（6）再以鋨酸固定，脫水包埋。
也可以先超薄切片，再進行鐵蛋白－抗體結合物染色。操作如下：
⑴ 將培養細胞以1%福馬林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗滌離心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中，再將袋置於吸水劑粉末上，待牛血清白蛋白成膠狀物時，將透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。
⑷ 取出，切成小塊，以PBS液洗滌。
⑸ 置乾燥器中以矽膠乾燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置於經4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網上(牛血清白蛋白的處理在於減少鐵蛋白結合物非特異性吸附於載網上)。
⑺ 滴一滴鐵蛋白－抗體結合物於載網上。
⑻ 5min後，浮網於PBS液面,標本面向下，以除去多餘的結合物。
⑼ 涼乾後，滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復染。
⑽ 水洗、晾乾、電鏡觀察。
結果判定
在已知對照樣品成立的前提下，凡是出現黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性(+)，否則判為陰性(－)。
