folin酚試劑法測定蛋白質含量

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的套用。這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是套用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。

基本介紹

• 中文名：folin酚試劑法測定蛋白質含量
• 確定：Lowry
• Lowry確定：蛋白質濃度測定的基本步驟
• 套用：生物化學領域

原理

此法的顯色原理與雙縮脲法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。

器材

721型分光光度計，恆溫水浴鍋

實驗步驟

樣品測定

取1ml樣品溶液（約含20-250μg多肽或蛋白質），加入5ml試劑甲，混勻，於20-25℃放置10min.再加入0.5ml試劑乙（Folin氏試劑），立即振盪搖勻，在20-25℃保溫30min，然後於500nm處比色。以1ml水代替樣品作為空白對照。

標準曲線的制定

取14支試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml標準蛋白質溶液（250μg/ml),用水補足到1ml，然後按上述方法進行操作，測定光密度值。取兩組測定的平均值，以蛋白質濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪製標準曲線作為定量的依據。

優缺點

這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾folin-酚反應（Lowry反應）。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩衝液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

注意事項

進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。

測定範圍

通常測定範圍是20-250μg。此法可檢測的最低蛋白質量達5μg。