基本介紹
- 中文名：金屬硫蛋白
- 外文名：metallothionein
- 產生對象：微生物和動植物
- 性質：金屬結合蛋白
發現,研究,理化性質,分類分布,提取方法,純化方法,檢測方法,有關功能,其他作用,心血管病,與腫瘤,安全性,用途,市場狀況,
發現
1957年，美國科學家Margoshoes在研究金屬生物學作用時，從動物器官中分離出鎘的金屬蛋白質。由於它是一種低分子量、高巰基含量,能大量結合重金屬離子，因此稱為金屬硫蛋白（簡稱MT）。MT分子呈橢圓形，分兩個結構域,分子量為6,000～7,000道爾頓,直徑30～50 A,含有61個胺基酸,其中20個胺基酸為半胱氨酸，少數有21個,這樣每一個MT分子就可以結合7～12個金屬離子。人體、動物、植物以及微生物體內均含有MT，而且其理化特性基本一致，具有特殊的光吸收。MT構象較堅固,具有較強的耐熱性。
金屬硫蛋白
金屬硫蛋白MT的用途
MT 的重要生理功能表現在它是一種目前所知的最有效的自由基清除劑，其清除自由基（·OH）的能力約為SOD的幾千倍，而清除氧自由基（·O）的能力約是谷胱甘肽（GSH）的25 倍，而且具有很強的抗氧化活動。
由於 MT 具有特殊的化學結構，其中的金屬具有動力學不穩定性，巰基具有親核性傾向，使得MT 易與某些親電性物質，特別是與某些自由基相互作用。
研究
對於金屬硫蛋白的研究,國內外主要集中在提取、檢測以及套用上。由於在實際生產中,主要採用層析法,分離純化後的金屬硫蛋白中還含有其它的雜蛋白,因此本文作者正在進行金屬硫蛋白的分子印跡聚合物的研究,使其更好地套用於金屬硫蛋白的純化。
理化性質
MT構象較堅固,具有較強的耐熱性,生物學性質穩定,同時抗酶解,而且蛋白質氮基酸排列有重複性,在胺基酸鏈斷掉一部分後仍會有活性。MT所有的半胱氨酸以還原狀態出現。
一般來說，哺乳動物的MT分子量為6000～7000道爾頓，但去金屬後即硫蛋白分子量為6000道爾頓左右，而真核微生物的MT分子量範圍較大，為2000～10000道爾頓，如從粗糙脈孢菌中分離出來的MT分子量為2500道爾頓左右，酵母菌中分離得到的MT分子量為8000～10000道爾頓。高等植物的MT的分子量為10000～13800道爾頓。MT的等電點pI一般在4左右，如哺乳動物MT的等電點在3.9～4.6之間，已發現的水生生物MT的等電點在3.5～6.0之間。使各種金屬硫蛋白中50%的金屬離子發生解離的pH分別為Zn-MT 3.5～4.5,Cd-MT 2.5～3.5，Cu-MT pH﹤1.0，但對植物中的MT來說，相應的pH要偏高些。MT的存在形式及穩定性與它所結合金屬的種類，是否結合了金屬及環境的pH密切相關。同樣，MT的光吸收特徵除了與它的胺基酸組成有關外，也與它所結合的金屬種類密切相關。
金屬硫蛋白
金屬硫蛋白分類分布
提取方法
主要試劑：
動物的處理：
參考Onsaka等的方法，給家兔皮下注射ZnSO44次，第1天注射60mg/只（約15mg Zn/kg），第2、4天注射90mg/只，第7天注射120mg/只，第8天處死動物取其內臟。
MT粗製品的製備：
1）稱重：將前一夜放-4℃冰櫃中解凍的試樣拿出來用托盤天平稱重，試樣重量M，精確到0.1g；
2）攪碎：將試樣用剪刀剪成碎片後，用搗碎機搗約30～50s，搗成勻漿；
3）提取：加入相當於試樣重量兩倍體積的0.02MTris-HCl，用磁力攪拌器攪約半分鐘；
4）變性：加入等體積氯仿：乙醇（0.08：1）變性除雜蛋白，攪拌約5分鐘；
5）離心：5000rmp、4℃離心25min，棄沉澱，取上清；
6）熱變性：75℃熱變性3～5min除雜蛋白；
7）過濾：用冰塊速冷後用8層紗布過濾，取清液，靜置約2h；
8）離心：8000rmp、4℃離心25min，棄沉澱，取上清，得到勻漿液。
9）層析、凍乾：對勻漿液進行層析，然後收集富含MT的層析液進行凍乾即得MT粗品。
純化方法
所謂純化，也就是MT粗品（60%～90%）、MT精品（≥90%）以及純品（≥95%）的形成過程。由報導的資料看，純化方法大概是一致的，首先是根據MT-1和MT-2所帶電荷不同的性質，進行離子交換將MT-1和MT-2分開，然後將收集MT-1和MT-2的層析液分別進行脫鹽，最後收集凍乾、保存。
取勻漿液直接上Sephadex G-50柱（4.5×100cm）進行分離，以0.01mol/LTris-HCl，pH8.6緩衝液洗脫。收集含MT組分層析液，再上預先用0.01mol/L Tris-HCl，pH8.6緩衝液平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow（3×70cm）柱進行離子交換層析，以Tris緩衝液進行直線梯度洗脫（A液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.6； B液：0.25mol/L Tris-HCl，pH8.6）。分別收集含MT-1和MT-2組分，冷凍乾燥濃縮成體積15～20mL，再分別上預先用0.01mol/L碳酸銨平衡好的Sephadex G-25柱（1.6×120cm）進行脫鹽。所得MT-1和MT-2冷凍乾燥後保存於-20℃冰櫃中。
雖然文獻中講到許多分離純化方法，但是多為實驗室研究，真正運用到實際生產的並不多，這主要與實際生產中的各種環境因素的影響有關。在實驗中發現，誘導後家兔肝臟中MT的含量愈高，實際生產中MT的提取率就愈大，相反，MT的提取率就愈低。
檢測方法
隨著對MT研究的進一步深入，建立的MT檢測方法較多，但所有這些方法都是建立在MT的理化特性和生物特性以及免疫學特性基礎上，主要分以下幾大類。
金屬親和分析法
這類方法主要是基於MT對金屬的高親合力且不同金屬的親和力具有差異性及其熱穩定性而建立的。主要通過測定MT結合金屬—競爭性替換金屬含量來檢測MT中金屬含量的增高，從而計算出MT的含量。張保林等運用銀飽和分析法結合原子吸收光譜（AAS）檢測了兔肝Zn-MT，具體方法為：向含MT的溶液中加入過量的Ag+，待反應完全後，再逐次加入血紅蛋白，以結合剩餘的Ag+，加熱使血紅蛋白沉澱，與MT結合的Ag+則完全存在於上清液中，通過AAS測定其中Ag+含量，便可計算出MT的濃度，該方法與其它方法比較，不需要去除樣品中共存的其它蛋白質和含-SH基劑，可直接計算出MT含量，且不需要特殊的儀器設備，操作簡便，具有很高的重複性和準確性。金屬親合分析的缺陷在於，採用的金屬除與MT結合外，還與其它一些小分子量化合物結合，由於利用金屬含量間接推算MT含量，因此特異性較差。
電化學法
運用檢測MT的電化學方法有：示差脈衝極譜法（DPP）、微分脈衝極譜法、示差脈衝陽極溶出伏安法（DPASV）和循環伏安法（CV）等。Bordin等通過改變檢測體系的pH值，利用DPP可以很方便地檢測出樣品中多種形式的MT，同時能快捷地分析出還原型的MT。
色譜分析法
對MT中不同亞型的檢測，色譜分析法較為適合，套用的色譜分析法主要有HPLC、RP-HPLC、HPLC-ICP-MS、HPLC-AAS等，利用這類分析方法可以對Zn-MT的性質進行檢測分析，但此類方法需要有標準的MT樣品進行對照。Hunziker等使用RP-HPLC從兔組織樣品中可以分離出7種亞型，通過AAS來檢測樣品中的金屬含量，可以對MT進行定量測定。Jin等利用HPLC分離MT，然後根據樣品對250nm紫外吸收特徵來直接對MT定量，該方法的靈敏度小於1μg/mL。由於常見的兩種MT所帶的電荷不同，與其它方法相比，利用毛細管電泳法可以更好地分離純化MT-Ⅰ和MT-Ⅱ。
蛋白質分析法/免疫法
此類方法主要是通過蛋白質含量測定來計算MT濃度，免疫法是最主要的方法。它尤其適合於微量檢測，具有靈敏、特異的特點，靈敏度在pg/ml級，對存在體液中含量甚微的MT具有較好的檢測效果。在近些年，先後建立了Western Blotting法、放射性免疫檢測法（RIA）和酶聯免疫吸附法（ELISA）。
RIA法首先由Mallie等在1979年檢測大鼠血清中MT的含量時建立的，隨後Mulder等建立了測定人體液中MT含量的RIA，Zahir Shaidh A等報導了用RIA檢測鎘污染地區人群的尿液MT含量。此方法的檢測範圍在0.1～100ng/ml之間，但是此方法要用放射性同位素，需要3天左右的時間，給檢測帶來不便。
1986年Thomas等建立了ELISA法，與RIA法無顯著差異，靈敏度可達100pg/ml，與RIA相比具有測定相對迅速，且不需昂貴的儀器設備和接觸放射性同位素。Akintola等在1995年利用MT-1製備抗體建立了ELISA測定人血漿和尿液中的MT含量，檢測限可達5ng/ml。鄭軍恆等在檢測人血液中的MT過程中建立了2種ELISA方法，直接型ELISA的檢測範圍為1～10ng，可用於檢測較純樣品，競爭性ELISA較好的檢測範圍是50～500ng，用於檢測較粗的樣品中MT的含量。
光譜法
採用液相色譜（LC）和紫外（UV）相結合檢測確定家兔肝臟中分離脫金屬硫蛋白的最佳條件，同時，利用LC-ES-MS可以確定家兔肝臟中不同結構的脫金屬硫蛋白，主要對MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的結構及其同分異構體進行了研究。
由於目前金屬硫蛋白的測定主要採用紫外-可見分光光度法以及原子吸收光譜法測定其中的金屬離子。前一種方法靈敏度較低，由於檢測取樣少，檢測過程中造成的誤差較大，後一種方法卻因為分離純化過程中可能有部分金屬脫離蛋白造成損失引起誤差，且測定費用昂貴。針對這種情況，建立了鎘金屬硫蛋白的非原子化測定方法，檢出限與石墨爐法（GFAAS）相近。
克隆及檢測
隨著分子生物學技術的快速發展，使MT克隆技術、RNA印跡技術和PCR技術套用於MT的定量檢測成為現實。MT克隆檢測是通過MT多克隆和單克隆抗體，運用免疫擴散、免疫電泳等方法來檢測組織中的MT-mRNA含量進行定量分析，這在MT分子的生物學研究中有很重要的意義。
MT多採用在線上檢測，雖然以免疫法最為可靠，但是檢測過程複雜，時間消耗大，在線上檢測大大節省了時間，同時可以減少檢測過程中產生的誤差。MT在逐步產業化，然而目前還缺乏一種簡便、靈敏、快捷適宜產業化的分離純化和檢測技術，這也成為MT研究的熱點。
有關功能
重金屬解毒功能
MT是富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，其巰基能強烈螯合有毒金屬，並將之排出體外，從而實現解毒功能。MT與痕量金屬的代謝有關，在所有的哺乳動物組織中，MT-1和MT-2協同表達。MT-3是該家族中的腦部特異成員，能結合鋅和銅，具有重要的神經生理和神經調節功能。對許多水生生物的研究表明，MT在基本金屬元素的調節中起重要作用，並且對非基本的金屬元素有抑制和解毒作用。MT通過與重金屬結合可以有效的減輕重金屬對機體的毒害，是目前臨床上最理想的生物螯合解毒劑。
環保作用
利用MT與金屬結合的特性，可以選育或用基因工程手段建立MT的高表達系統，以治理重金屬污染。據報導，轉酵母MT基因的菸草能顯著提高對污染土壤中cu2的吸收，用這種方法可以對重金屬污染區進行補救。
MT與抗輻射
電離輻射可以產生大量自由基，直接或間接使生物體受到損傷。據研究表明，口服MT能夠延長被一次性大劑量電離輻射的小鼠的存活時間，降低一次性大劑量和多次小劑量電離輻射對免疫系統的損傷，口服MT能吸收進入體內的大量Cys，為修復體內受輻射作用而斷裂的二硫鍵提供原料。
MT與Parkison(PD)病
許多實驗證明，MT對神經系統有保護作用。實驗顯示，在轉基因小鼠中，MT-1的過表達可以改變腦炎症狀，促進腦修復，是神經細胞中的保護因子。通過鼠刺傷模型和缺血模型的研究發現，MT一3參與中樞神經系統損傷修復。PD病是由於6一羥基多巴胺誘導自由基而產生的，而腦中某些MT異構體的誘導劑，如氧化壓力、細胞因子和炎症過程等能防止這種神經毒害，這與MT清除自由基有關。
其他作用
心血管病
MT作為一種強的內源性細胞保護劑，在心血管系統抗損傷保護中發揮著重要作用，主要表現在對缺血再灌注損傷的抑制作用。臨床實踐證明，缺血預處理能提高體內MT含量，從而減輕再灌注造成的損傷。據實驗證明，MT參與預缺血的心肌細胞保護，並通過保護氧化酶活力減輕心肌細胞缺氧/復氧所導致的損傷。
與腫瘤
安全性
1、LD50﹥10g/kg
3、亞慢性毒性試驗：陰性
用途
金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸和金屬的低分子蛋白質。由於它大量的結合多種金屬離子，具有特種的生理功能，為生物化學領域所重視。
MT的研究已有 40多年的歷史, 對其結構、特性、基因調控及生物學功能的研究日趨深入，研究成果已涉及醫學、毒理學、營養學、生物工程、美容護膚等各個領域，套用前景十分廣闊。
市場狀況
根據MT在化妝品、保健品和新醫藥等三個領域的套用發展情況，結合我國消費者的實際水平，以及新醫藥發展的步驟和速度，化妝品行業年需求20千克左右，嬰幼兒食品添加年需求10㎏左右，中老年保健食品年需求10-20千克，新醫藥年需求20千克左右，而產量為：2003年為6.8千克，2004年為8.6千克，2005年為9.5千克，遠遠不能滿足實際需求。2005年國內市場價：化妝品、保健品用300萬元/千克，醫藥用800-1000萬元/千克。2005年國外最新報價為8250萬美元/千克（商品號M7641）。
目前國內採用的都是用兔肝生產金屬硫蛋白，設備投入大，轉讓費高，而且產量低，中國科學院專家經過幾年的努力研製出用豬肝生產金屬硫蛋白技術，項目技術成果整體上居同類研究的國際先進水平，已獲國家發明專利，並通過鑑定，獲得國家自然科學基金的資助。
