ES細胞的全能性指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內的各種組織的發育潛力,即ES細胞具有發育成完整動物體的能力,可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的試驗材料。ES細胞發育全能性的標誌是ES細胞表面表達時相專一性胚胎抗原(Stage specific embryonicant,SSEA),而且可以檢查到Oct4基因的表達,這兩種蛋白是發育全能性的標誌。ES細胞中AKP及端粒酶活性較高,可用於ES細胞分化與否的鑑定。ES細胞的多能性是指ES細胞具有發育成多種組織的能力,參與部分組織的形成。將ES細胞培養在不含分化抑制物的培養基上,可以形成類胚體。將ES細胞在特定培養基進行培養,可以定向分化成特定組織,如ES細胞在含有白血病抑制因子(LIF)和維生素A酸(RA)的培養基上,可以分化形成全壁內胚層,將ES細胞與胚胎細胞共培養或將ES細胞注入囊胚腔中,ES細胞就會參與多種組織的發育。
小鼠ES細胞的分離方法基本成熟,且已廣泛套用於生命科學研究的各個領域。1981年Evans首次分離得到小鼠ES細胞,他以手術切除受精後2.5 d小鼠卵巢並結合激素注射干擾子宮環境,從而使胚胎延遲著床,再回收胚胎,將其體外培養於STO細胞飼養層上,結果得到了小鼠ES細胞系。Martin G R以免疫外科法剝離小鼠囊胚滋養層細胞,得到內細胞團(ICM)並將其置於STO細胞飼養層上,培養基為小鼠PSA-1 ES細胞條件培養基,結果也得到小鼠ES細胞。此後,Axelord等用微滴法得到小鼠ES細胞系;Kaufman等用單倍體延遲著床小鼠囊胚建立同源二倍體ES細胞系;Wobus等首次用原代小鼠成纖維細胞作飼養層建立了小鼠ES細胞系;Smith等首次使用大鼠肝細胞條件培養基作為分化抑制物建立了小鼠ES細胞系。Brook F A等進一步完善了小鼠ES細胞的分離方法,以致從許多品系小鼠包括近交系和突變系,都可獲得ES細胞。分離小鼠ES細胞並非只能從囊胚,也並非必須依賴飼養層細胞。Dhhaise等將52枚8-細胞小鼠胚胎消化成單個分裂球並培養於小鼠原代成纖維細胞飼養層上,所用培養基為DMEM/F12,並添加100 mL/L的胎牛血清、100 mL/L的新生犢牛血清和0.1 mmol/L的2-巰基乙醇,5天后,出現多個幹細胞集落,消化傳代後建立了一個ES細胞系MSB1。將MSB1注入SCID(severe combined immunodeficient mice)小鼠,能產生包含三胚層分化物的畸胎瘤,注入52枚囊胚產生了2個活的個體(1雄,1雌),但雄性個體無生殖能力。Tojo等用同樣方法從雜交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-細胞胚也得到了ES細胞。小鼠ES細胞具有無限增殖的自我更新能力。Suda Y等將小鼠ES細胞傳250代以上沒有出現轉化的跡象,它們仍具有正常的二倍體核型;在生殖系嵌合體中能產生正常的配子;作為核供體能重組克隆胚胎。上述結果表明小鼠ES細胞是永生性的。
大鼠ES細胞
Iannaccone P M等從大鼠PVG近交系分離克隆大鼠ES細胞系-RESC-01,該細胞系對SSEA-1和AKP呈陽性,在大鼠胎兒成纖維細胞飼養層上能很好的增殖,在體內環境能分化形成多種細胞類型。RESC-01細胞系在體外懸浮培養時形成的胚體出現有節律的收縮運動,將其注入囊胚並移植假孕母鼠能生成嵌合體。Kawase等也利用大鼠胎兒成纖維細胞做飼養層,從DA大鼠品系分離建立了RES-DA1ES細胞系,它與小鼠ES細胞形態相似,表達AKP和4C9抗原。Brenin等也用不同的方法分離得到了ES細胞。Sun等以大鼠ES細胞為核供體,得到了核移植後代。Vassilieva等發現大鼠ES細胞表達SSEA-1、Oct-4和IL-6等細胞標記。
豬ES細胞
Piedrahita J A等採用STO、豬成纖維細胞和豬子宮上皮細胞作為飼養層,以DMEM為基礎培養液,從豬囊胚ICM分離ES細胞,發現豬囊胚ICM在STO或PMEF飼養層上可以附著增殖,而在豬胎兒成纖維細胞飼養層上雖可附著但增殖甚微,傳不過4代即發生死亡。Evans等將6天~7天豬囊胚直接培養於STO飼養層上,挑出ICM細胞經增殖傳代培養建立了豬ES細胞系。Strojek R M等認為分離豬ES細胞的最適胚胎為第10天囊胚。研究表明,6日齡~7日齡胚胎在培養過程中極易發生死亡,ICM克隆獲得率極低,而第10天的胚胎容易培養,ICM克隆獲得率較高,但細胞易於分化。Vasil’ev I M等研究了胚胎髮育階段、培養基種類、飼養層細胞等影響豬ES細胞分離的因素,結果表明不同發育階段的附植前囊胚是影響豬ES細胞分離的限制性因素。Wheeler M B等報導豬ES細胞能形成正常的嵌合體和包含三胚層分化物的囊狀胚體,在維甲酸和DMSO的作用下,豬ES細胞能分化形成上皮細胞、肌肉細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等,Miyoshi等從體外授精囊胚分離得到豬ES細胞,並以類ES細胞為核供體,獲得了核移植囊胚。國內關於豬ES細胞分離克隆的研究相對較少,李松等分離得到豬ES細胞並傳至第2代,在此基礎上,徐軍等將豬ES細胞傳至3代,馮秀亮等將豬ES細胞傳至5代,馮書堂等也分離得到豬ES細胞,同時對所分離的細胞進行了初步檢測和鑑定,證明其具有多能性。
牛ES細胞
Saito等在加有LIF的培養基中對牛ICM進行培養,分離得到牛ES細胞並進行傳代。Sims等使用與一般ES細胞分離完全不同的低密度培養法,使用BRL(buffalo rat liver)條件培養基並添加亞硒酸鈉、胰島素、運鐵蛋白和50 mL/L胎牛血清,培養6 d~10 d,得到15個ES細胞系,將其作為核供體進行核移植得到659枚重構胚,卵裂率70%,囊胚率24%,將其中34枚胚胎移植27頭假孕母體,13頭妊娠,最後生出4頭犢牛。而Stice S L等報導,以牛ES細胞為核供體建立的重組胚在移植受體後雖然會出現妊娠現象,但妊娠時間不超過60天,主要是因為胎盤畸形發育,包括缺乏子葉以及子宮阜出血反應。若將重組胚與正常8-細胞胚嵌合,則該嵌合胚可發育至85天,胎兒同樣缺乏子葉,DNA分析證實50%的嵌合體胎兒組織來源於ES細胞。Ito等分析比較了牛體內和體外培養的桑椹胚分裂球和囊胚ICM分離ES細胞的效果,結果僅在囊胚組獲得了類ES細胞。Cibelli等由49枚7日齡牛胚胎ICM分離到27個ES細胞系,用注射法將β-半乳糖苷酶基因導入ES細胞,選擇轉染的ES細胞注入8-細胞~16-細胞牛胚,其中18枚胚胎移植7頭受體,妊娠5周后,得到12個胎兒。對胎兒進行檢測,6個胎兒分別在生殖腺或原始生殖細胞(PGCs)中檢測到標記基因,表明ES細胞參與生殖系嵌合。Cibelli等建立套用牛胎兒成纖維細胞核移植生產轉基因牛類ES細胞的方法,得到6頭嵌合體。Mitalipova等自緻密桑椹胚分離牛ES細胞,最高一株ES細胞傳至150代,且表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4和c-kit受體。
Graves K H等從兔子附植前囊胚分離得到ES細胞,並進行了初步鑑定,證明它們具有在飼養層上保持未分化狀態的增殖能力,體外傳代培養1年以上,仍具有正常的核型,且能形成包含三胚層分化物的胚體。之後,Niemann等以PMEF為飼養層,建立了9個兔ES細胞系。Schoonjans L等將兔ES細胞注入囊胚獲得了包括生殖系在內的嵌合體兔子。陳穎等以PMEF為飼養層培養兔分割囊胚,結果得到傳至7代的兔ES細胞,將第2代的兔ES細胞與囊胚進行嵌合,得到1隻皮毛嵌合體仔兔,但未證實ES細胞是否參與了生殖系嵌合。