基本介紹
發展歷史,以納米金為免疫標記物的檢測技術的發展,1.1 作為顯微鏡示蹤物,1.2 套用於均相溶膠顆粒免疫測定技術,1.3 套用於流式細胞儀,1.4 套用於斑點免疫金銀染色技術,1.5 套用於免疫印跡技術,1.6 套用於斑點金免疫滲濾測定技術,1.7 套用於免疫層析技術,1.8 生物感測器,1.9 生物晶片,納米金技術在食品安全快速檢測中的套用,2.1 獸藥殘留,2.2 動物傳染病,2.3 農藥殘留,2.4 致病微生物檢測,2.5 真菌毒素的檢測,小 結,製備方法,
發展歷史
自從16世紀歐洲現代化學的奠基人、傑出的醫師、化學家Paracelsus製備出“飲用金”用來治療精神類疾病以來，納米金就開始登上了科學的舞台。1857年英國科學家法拉第在研究道爾頓的理論時，利用氯化金還原出含納米金的溶液，發現在其中加入少量電解質後，可使溶液由紅寶石色變為藍色，並最終凝集為無色，而加入明膠等大分子物質便可阻止這種變化。儘管當時並不知道原因，但他的發現為納米金的套用奠定了科學基礎。1885年納米金溶液在美國常作為治療酗酒的主要成分；1890年Koch醫生髮現結核桿菌不能夠在金的表面存活；1890年納米金被用來治療關節炎；1935年芝加哥外科專家Edward等人發現納米金溶液能有效的減輕患者病痛，強健體質。1939年Kausche和Ruska用電子顯微鏡觀察金顆粒標記的菸草花葉病毒，呈高電子密度細顆粒狀。1971年Faulk和Taylor首次採用免疫金染色(immunogold staining，IGS)將兔抗沙門氏菌抗血清與納米金顆粒結合，用直接免疫細胞化學技術檢測沙門氏菌的表面抗原，開創了納米金免疫標記技術。
以納米金為免疫標記物的檢測技術的發展
作為現代四大標記技術之一的納米金標記技術(nanogold labelling techique)，實質上是蛋白質等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是納米金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合，而且吸附後不會使生物分子變性，由於金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中。由於球形的納米金粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共價結合，因而在基礎研究和實驗中成為非常有用的工具。
納米金溶液
納米金溶液1.1 作為顯微鏡示蹤物
1978年，Geobegan等將納米金標記抗體用於普通光鏡下檢測B淋巴細腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)。1981年 Danscher用銀顯影方法增強金顆粒的可見度，並提高了靈敏度。Holgate等人於1983年建立了用銀顯影液光鏡下金顆粒的可見性的免疫金銀染色法(immunogold-siliver staining，IGSS)，利用銀的增強作用，加大單獨金粒子在光鏡下可視粒子的半徑，增加了小顆粒金粒子的標記密度，提高了靈敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基礎上成功地進行了彩色IGSS法，使得結果更加鮮艷奪目。儘管如此，由於亞硝酸銀化合物是光敏性的，需要在暗室里進行標記，實驗操作非常的不便，改用非光敏的醋酸銀化合物，價格又過於昂貴，所以納米金在光鏡中的套用日漸減少。而利用納米金的高電子密度，能在電鏡下清晰的分辨顆粒，作為在透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(sEM)和螢光顯微鏡的示蹤物在電鏡免疫化學和組織化學中得到了廣泛套用。
1.2 套用於均相溶膠顆粒免疫測定技術
均相溶膠顆粒免疫測定法(sol particle immunoassay， SPIA)是利用免疫學反應時
金顆粒凝聚導致顏色減退的原理，將納米金與抗體結合，建立微量凝集試驗檢測相應的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。已成功地套用於PCG的檢測，直接套用分光光度計進行定量分析。
1.3 套用於流式細胞儀
套用螢光素標記的抗體，通過流式細胞儀(Flow CytoMeter，FCM)計數分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但由於不同螢光素的光譜相互重疊，區分不同的標記很困難。Boehmer等研究發現，納米金可以明顯改變紅色雷射的散射角，利用納米金標記的羊抗鼠Ig抗體套用於流式細胞術，分析不同類型細胞的表面抗原，結果納米金標記的細胞在波長632nm時，90度散射角可放大10倍以上，同時不影響細胞活性。而且與螢光素共同標記，彼此互不干擾。因此，納米金可作為多參數細胞分析和分選的有效標記物，分析各類細胞表面標誌和細胞內含物。
1.4 套用於斑點免疫金銀染色技術
斑點免疫金銀染色法(Dot-IGS，IGSS)是將斑點ELISA與免疫納米金結合起來的一種方法。將蛋白質抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應後，再滴加納米金標記的第二抗體，結果在抗原抗體反應處發生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點，此稱為斑點免疫金染色法(Dot-IGS)。此反應可通過銀顯影液增強，即斑點金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)。
1.5 套用於免疫印跡技術
免疫印跡技術(immunoblotting，IBT)也稱為免疫轉印技術，其原理是根據各種抗原分子量大小不同，在電泳中行走的速度不同，因而在硝酸纖維素膜上占據的位置也不同；把含有特異性抗體的血清和這一薄膜反應，那么特異性的抗原抗體反應就顯色。而納米金免疫印跡技術相比酶標記免疫印跡技術具有簡單、快速、具有相當高的靈敏度。而且套用納米金將硝酸纖維素膜上未反應抗體進行染色，評估轉膜效率，校正抗原一抗體反應的光密度曲線，即可進行定量免疫印跡測定。
1.6 套用於斑點金免疫滲濾測定技術
斑點金免疫滲濾測定法(dot immuno-gold filtration assay，DIGFA)是斑點免疫測定法(dot immunoboding assay，DIBA)中的一種，是1982年由Hawkes等人在免疫印跡技術基礎上改良發展起來的一項免疫學新技術。其原理完全同斑點免疫金染色法，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原(抗體)後，迅速加抗體(抗原)，再加金標記第二抗體，由於有滲濾裝置，反應很快，在數分鐘內即可顯出顏色反應。與斑點免疫滲濾測定法(d o t immunotietration assay，DIFA)相比，所不同的是免加底物液，直接由紅色膠體金探針顯色，結果鮮艷，背景更清楚，可以在室溫下保存。該方法已成功地套用於人的免疫缺陷病病毒(HI)的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。目前使用的有HCG試劑盒，AFP試劑盒，消化道腫瘤篩檢試劑盒。
1.7 套用於免疫層析技術
1.8 生物感測器
生物感測器(biosensor)是指能感應(或回響)生物、化學量，並按一定規律將其轉換成可用信號(包括電信號、光信號等)輸出的器件或裝置。在生物感測器方面，納米金主要設計為免疫感測器，是利用生物體內抗原與抗體專一性結合而導致電化學變化設計而成。另外由於納米金的氧化還原電位是+1.68V，具有極強的奪電子能力，能大大提高作為測定血糖的生物感測器葡萄糖氧化酶膜的活性，金顆粒越細，活性越大。
1.9 生物晶片
生物晶片是以膜、玻璃、矽等固相介質為載體，其最大的優點在於高通量、並行化、微型化。一次實驗可同時檢測多種或多份生物樣品。生物晶片包括基因晶片、蛋白質晶片、細胞晶片、組織晶片。目前，生物晶片用於食品安全檢測領域的套用主要包括農藥、獸藥殘留檢測，食品微生物檢測、動物疫病監測、轉基因動物植物檢測等。2002年Park等在《Science》雜誌上介紹了一種以納米金為探針的基於電荷檢測的新型基因晶片，該晶片具有非常好的靈敏度及特異性，可以在十萬分之一比率中檢測出單鹼基突變的基因片段。
納米金技術在食品安全快速檢測中的套用
目前食品檢測分析一般採用化學分析法(CA)、薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，但需要繁瑣、耗時的前處理，樣品損失也較大。相對於靈敏度較低的CA和TLC方法，GC、HPLC的靈敏度較高，但操作技術要求高、儀器昂貴，並不適合現場快速測定和普及，而以納米金為免疫標記物的檢測技術正彌補了這些技術的缺點，在現代食品分析檢測中的運用也越來越多。
2.1 獸藥殘留
所謂獸藥殘留是指動物產品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及，或其代謝物，以及與獸藥有關的雜質的殘留。獸藥殘留既包括原藥也包括藥物在動物體內的代謝產物。主要的殘留獸藥有抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲藥、激素藥類和驅蟲藥類。獸藥通常是通過在預防和治療動物疾病用藥、在飼料添加劑中使用以及在食品保鮮中引入藥物而帶來對食品的污染。人長期攝入含獸藥的動物性食品後，不但會對人體產生毒性作用，出現過敏反應，而且動物體內的耐藥菌株可傳播給人體，當人體發生疾病時，就給臨床上感染性疾病的治療帶來一定的困難，延誤正常的治療。另外有些殘留物還具有致畸、致癌、致突變作用。
Verheijen利用膠體金標記純化的抗鏈黴素單克隆抗體，對鏈黴素的檢測限為160ng/ml，檢測方便快速，不需要其他試劑和儀器，時間僅需lOmintl41。而使用膠體金免疫層析試紙條，在檢測蝦肉等組織試樣中殘留氯黴素(chloramphenicol，CAP)殘留時，靈敏度可達到 lng/ml，只需5～10min，並且與類似物沒有交叉反應。Yong Jin等也使用金標法來檢測動物血漿和牛奶中的新黴素殘留，其檢測限為10ng/mltl6J。鹽酸克倫特羅即β2受體興奮劑，俗稱“瘦肉精”能增強脂解和減慢蛋白質分解代謝，若在畜牧生產中使用，可明顯提高飼料轉化率和瘦肉率；但使用劑量過大，則會對動物和人(間接)的肝臟、腎臟等器官產生嚴重的毒副作用。儘管歐盟於1996年禁止在畜牧生產中使用該藥(EC Direc． tive 96/22/EC)，我國農業部也於1997年明令禁止，但國內“瘦肉精”中毒事件時有發生。劉見使用金標試紙法快速檢測檢測鹽酸克倫特羅，最小檢測量達到40ng/ml。現在商品化的試紙條產品現在也比較成熟，比利時UCB Bio-products公司開發的Tlhe Beta STAR檢測法就是將特定的β-內醯胺受體固定在試紙條上，用膠體金有色微粒作為標記物，5min內可以檢測到青黴素和頭孢黴素殘留。而國內的劉平在用生物電化學感測器檢測牛奶中殘留的青黴素時，認為使用納米金將有助於提高感測器的檢測限。
2.2 動物傳染病
動物傳染病不但會影響動物養殖經濟，也對人類健康構成威脅，聯合國糧農組織和世界衛生組織已把預防和控制嚴重的動物流行病作為其工作重點之一。蝦白斑病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是阻礙蝦養殖業發展的主要因素，至今還沒有有效的藥物，所以及早檢測出病毒，顯得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑點免疫金滲濾法(DIGFA)t19~和金標試紙法來檢測蝦白斑病毒，其中金標試紙法的檢測限為1 μg/ml，而使用銀增強，可以達到0.01μg/ml。賴清金等使用金標試紙條來檢測豬瘟病毒，10～15min就能檢出結果，並可根據檢測結果合理指導豬瘟免疫和建立適宜的免疫程式。禽流感病毒(AIV)是引起禽類急性死亡的烈性、病毒性傳染病，而且能感染人，我國許多地區也先後報導有高致病性禽流感的發生，給養禽業造成了重大的經濟損失，也嚴重威脅了人類的健康。劉永德等將兔抗禽流感H5、H9亞型病毒抗體純化後，分別與製備的膠體金研製成免疫金探針，用改良的滲濾法安全快速地檢測被檢材料中禽流感H5、H9亞型病毒，3min即可得到結果，檢測靈敏度分別為1.62ug/ml和1.25μg/ml。
2.3 農藥殘留
農藥殘留分析的困難包括：樣品基質背景複雜、前處理過程繁瑣，需要耗費較多的時間、被測成分濃度較低、分析儀器的定性能力受到限制、儀器檢測靈敏度不夠等一系列問題，但使用金標記的快速檢測可以很好的解決以上問題。國內的王朔分別使用納米金免疫層析和納米金滲濾法檢測西維因的殘留，整個檢測過程只需5min，檢測限也分別達到100ug/L和50μg/L。國內的生物技術公司也開發出了成熟的商品化產品，如克百威農殘速測試紙條等。
2.4 致病微生物檢測
目前基於金標記的快速檢測研究在致病微生物方面比較多，檢測的種類也比較多。最早Hasan以免疫磁性分離技術為基礎的免疫膠體金技術已成功套用於01群霍亂弧菌(Vibriocholerae)的檢測。國內洪幫興等人研究了以硝酸纖維膜為載體納米金顯色的寡核苷酸晶片技術，為在分子水平快速簡便的鑑別致病菌提供了可能，甚至可以檢出致病菌的耐藥性變異。該晶片技術對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒梭菌和空腸彎曲菌等10種(屬)具有高靈敏度和特異性，檢出水平可達10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR感測器快速檢測大腸桿菌時，引入膠體金複合抗體作為二次抗體大幅度增加質量，進一步擴大了檢測信號，同時延長膠體金複合抗體與微生物的結合過程，使檢測信號進一步穩定與放大，從而顯著提高了檢測精度，使該感測器對大腸桿菌的檢測精度由10.6 CFU/ml提高到10.1CFU/ml。金免疫滲濾法重要的食源性致病菌之一大腸埃希氏菌0157：H7，目前的檢測通常先以山梨醇麥康凱瓊脂(sMAC)進行初篩，然後用生化和血清學試驗做鑑定，一般需要24～48h，而採用膠體金免疫滲濾法檢測卻非常的簡便，在很短時間即可得到結果。
在致病菌快速檢測中金標試紙條的研究越來越廣泛。謝昭聰等套用膠體金免疫層析法檢測水產品中霍亂弧菌的研究中，增菌液霍亂弧菌含量為1CFU/ml，通過增菌12h後，即可套用膠體金免疫層析法診斷試劑檢出，而一般水產品霍亂弧菌檢測所採用的傳統常規方法，檢測時限長，增菌培養需8～16h，分離培養需14～20h，初步報告需30h以上，實際操作中，需要3d以上才能出報告。腸桿菌科的大屬沙門氏菌可引起人的沙門氏菌性食物中毒，王中民等人採用免疫滲濾法可檢出85%的引起食物中毒的沙門氏菌，靈敏度為2.4×107CFU/ml，對最常見的鼠傷寒、豬霍亂和腸炎沙門氏菌，檢出率達100%，而採用膠體金免疫層析法的靈敏度為2.1×106CFU/mlt30j。被美國列為七種主要食源性致死病菌之一的李斯特菌，如果按照傳統的分離培養和鑑定技術需要l～2周時間，而採用免疫膠體金層析法只需10min就能得到檢測結果，靈敏度達到87.5%。
2.5 真菌毒素的檢測
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)產生的具有毒性的二級代謝產物，廣泛存在食品和飼料中，人類若誤食受污染的食品，就會中毒或誘發一定疾病，甚至癌症。檢測食品中的真菌毒素常用理化方法或生物學方法。但理化法需要較昂貴的儀器設備，操作複雜。而運用免疫技術檢測真菌毒素敏感性高，特異性強，非常適用於食物樣品的檢測。D．J．Chiao等使用金標免疫層析法在10min之內即可檢測50ng/ml的肉毒桿菌毒素B(BoNT/B)，如果使用銀增強則其檢測限可以達到50pg/ml，而且對A、E型肉毒桿菌毒素沒有交叉反應。貉麴黴毒素是麴黴屬和青黴屬產生的一類真菌毒素，其中毒性最大、與人類健康關係最密切、對農作物的污染最重、分布最廣的是赭麴黴素A(OTA)，賴衛華等研製的赭麴黴毒素A快速檢測膠體金試紙條，檢測限達到了10ng/mlt331，遠遠低於目前我國對赭麴黴毒素的限量要求5μg/L。黃麴黴毒素B z的快速檢測國內也有很多研究，孫秀蘭研製的黃麴黴毒素B，金標免疫試紙條，其最低檢測限達到2．5ng/ml，而且能定性或半定量檢測食品中的黃麴黴毒素B，含量。
小 結
隨著科學技術的不斷發展，食品分析檢測技術也在不斷地更新、完善和迅速發展，尤其是快速檢測技術更能適應現代高效、快速的節奏和滿足社會的要求。儀器分析法可以保證數據的精確性和準確性，但其流程仍比較煩瑣。儘管以納米金為標記物的免疫分析法及其它速測技術的開發過程需投入較多資金和較長時間，但具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、價廉、樣品所需量少等優點，其靈敏度與常規的儀器分析一致，適合現場篩選，而且其中的金免疫層析技術正在向定量、半定量檢測和多元檢測的方向發展，更加體現出金標技術的優勢。總之，快速檢測技術的快速、靈敏、簡便等優點，使之在食品衛生檢疫和環境檢測中有著廣泛的套用價值和發展前景。
製備方法
配製濃度為2.44×10-3 mol/L 的HAuCl4·4H2O溶液、濃度為3.43×10-2 mol/L 的Na3C6H5O7·2H2O 溶液、濃度為1.00×10-4 mol/L 的 PVP 溶液, 以及濃度為0.391 mol/L 的NaBH4 溶液備用。在燒杯中加入10 mL 氯金酸溶液, 10 mL 或不加保護劑溶液, 80 mL 三蒸水, 將燒杯置於數顯測速恆溫磁力攪拌器上, 邊加熱邊攪拌, 攪拌的轉速設定為600 r/min, 加熱至75℃, 恆溫2 min, 用移液管移取一定體積的還原劑(Na3C6H5O7 或NaBH4)溶液,迅速一次加入到上述混合液, 開始計時, 使液體顏色恆定並持續加熱一段時間共9 min, 停止加熱, 繼續攪拌5 min 後, 停止攪拌, 冷卻至室溫, 所得液體為納米金溶膠。
