生理化鑑定

不同微生物體內的酶系統不同，新陳代謝的類型不同，所以對各種物質利用後所產生的代謝產物也不同，因此可以利用微生物的生理生化反應來測定微生物的代謝產物，來鑑定在形態上難以區別的微生物。生理化鑑定主要從菌株對碳源利用、硝酸還原、澱粉水解、纖維素利用、明膠是否液化、硫化氫產生、牛奶是否凝固和腖化等指標來進行分析。

基本介紹

• 中文名：生理化鑑定
• 外文名：physiological and biochemical identification
• 鑑定過程：通過微生物的代謝產物鑑定
• 鑑定指標：菌株對碳源利用、硝酸還原等
• 鑑定依據：不同微生物體內的酶系統不同
• 套用：多用於水的細菌學檢驗

生理化鑑定簡介

不同微生物體內的酶系統不同，新陳代謝的類型不同，所以對各種物質利用後所產生的代謝產物也不同，因此可以利用微生物的生理生化反應來測定微生物的代謝產物，來鑑定在形態上難以區別的微生物。此方法多用於水的細菌學檢驗。大腸桿菌雖然為非致病菌，但其在飲用水中如果超過一定數量，表示該水受糞便污染。產氣腸桿菌廣泛存在於自然界中，檢驗水時要將其與大腸桿菌區分開。

乙醯甲基甲醇試驗(VP試驗)

1、原理

某些細菌在糖代謝過程中，能分解葡萄糖產生丙酮酸，兩個分子丙酮酸經縮合和脫羧生成乙醯甲基甲醇。乙醯甲基甲醇在鹼性條件下，被空氣中的氧氣氧化成二乙醯，二乙醯與蛋白腖中精氨酸等胍基化合物的胍基起作用，生成紅色化合物，此反應為乙醯甲基甲醇的陽性反應，沒有紅色化合物產生則為陰性反應。如果培養基中胍基太少，可加少量含胍基的化合物(如肌酸)，使反應更加明顯。在培養基中加入少量的α一萘酚作為顏色增強劑，可使反應加快。此試驗又稱為伏一普試驗，如圖1。

圖1

2、步驟

(1)製備緩衝葡萄糖蛋白腖水培養基，裝入試管中，每管10mL。

(2)製備大腸桿菌、枯草桿菌和產氣腸桿菌的斜面培養物。

(3)取葡萄糖蛋白腖水培養基12管，留3管作對照(不接菌)，其餘9管分3組分別接種大腸桿菌、枯草桿菌和產氣腸桿菌，每組接種3管。

(4)將以上12管置於37℃恆溫箱內培養。

(5)培養2～7d後取出，每管加入40%KOH溶液10～20滴，搖勻，再加入等量的5%α一萘酚乙醇溶液，拔去管塞用力振動，以使空氣中的氧氣溶入，如果需要還可在試管中加入微量肌酸(用牙籤挑入0.5～1mg)，再將試管放在37℃恆溫箱中保溫培養15～30min(或在沸水浴中加熱1～2min)後，如果培養液出現紅色，此反應即為VP試驗陽性(用“+”表示)，如果不呈紅色，則為VP試驗陰性(用“一”表示)，將VP反應結果記錄圖2中。

圖2

甲基紅試驗(MR試驗)

1、原理

甲基紅試驗是用來檢測葡萄糖產生的有機酸。有些微生物在糖代謝過程中，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，使培養基變成酸性，其pH下降至4.2或更低，使加入到培養基中的甲基紅指示劑由橘黃色(pH 6.3)變為紅色(pH4.2)，變為紅色的現象稱為甲基紅試驗陽性反應(用“+”表示)，如果仍為黃色，則為甲基紅試驗陰性反應(用“一”表示)。甲基紅的變色範圍為pH 4.2(紅色)至pH6.3(黃色)。

雖然所有的腸道微生物都能發酵葡萄糖產生有機酸，但通過甲基紅試驗仍然可以將大腸桿菌和產氣腸桿菌區分出來。二者在培養的早期都產生有機酸，但大腸桿菌在培養後期仍能維持酸性(pH 4)，而產氣腸桿菌則會將有機酸轉化為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使pH由4上升至6，所以，大腸桿菌為甲基紅試驗陽性反應，產氣腸桿菌為甲基紅試驗陰性反應。

有些微生物能將新產生的酸進一步轉化為中性化合物，如乙醯甲基甲醇、2，3一丁二醇，表現為VP反應陽性。因此，甲基紅試驗與乙醯甲基甲醇試驗對鑑定腸道細菌非常重要。

2、步驟

(1)製備緩衝葡萄糖蛋白腖水培養基，裝入試管中，每管10mL。

(2)配製甲基紅試劑 甲基紅0.1g、95%乙醇300.0mL、蒸餾水300.0mL。

(3)製備大腸桿菌和產氣腸桿菌的斜面培養物。

(4)取葡萄糖蛋白腖水培養基9管，留3管作對照(不接菌)，其餘6管分2組分別接種大腸桿菌和產氣腸桿菌，每組接種3管。

(5)將以上9管置於37℃恆溫箱內培養。

(6)培養2～5d後取出，每管加入甲基紅試劑1～3滴，注意沿管壁慢慢加入，不要加太多，以免出現假陽性。仔細觀察培養液上層，如果培養液上層變為紅色，即為甲基紅試驗陽性，如果仍為黃色，則為甲基紅試驗陰性。將甲基紅試驗反應結果記錄圖3中。

圖3

靛基質試驗

1、原理

靛基質試驗是用來檢測吲哚的產生。有些細菌能產生色氨酸酶，氧化分解蛋白腖中的色氨酸生成吲哚和丙酮酸，吲哚無色，但吲哚可與對二甲基氨基苯甲醛結合，生成紅色的玫瑰吲哚，產生玫瑰紅色的現象，即為靛基質試驗陽性反應(用“+”表示)，如果沒有產生玫瑰紅色的現象，即為靛基質試驗陰性反應(用“一”表示)。不是所有的微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此，靛基質試驗可以作為微生物生化檢測的指標。大腸桿菌靛基質試驗反應陽性，產氣腸桿菌靛基質試驗反應陰性。

如果玫瑰紅色不明顯，可加入4～5滴乙醚，充分振動，使乙醚分散到培養液中，如果培養液中有吲哚產生，吲哚可溶於乙醚中，再將培養液靜置片刻，待乙醚浮到液面形成明顯的乙醚層後，再加靛基質試劑，吲哚和靛基質試劑被濃縮，使顏色反應更明顯。

2、步驟

(1)製備緩衝葡萄糖蛋白腖水培養基，裝入試管中，每管lOmL。

(2)配製靛基質試劑。

(3)製備大腸桿菌和產氣腸桿菌的斜面培養物。

(4)取葡萄糖蛋白腖水培養基9管，留3管作對照(不接菌)，其餘6管分2組分別接種大腸桿菌和產氣腸桿菌，每組接種3管。

(5)將以上9管置於37℃恆溫箱內培養。

(6)培養2～5d後取出，在每管培養液中加入4～5滴乙醚，充分振動，再靜置1～3min，使乙醚層浮在培養液的上面。

(7)沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑，如果乙醚層與培養液界面出現紅色環狀物，即為靛基質試驗陽性，否則為靛基質試驗陰性。注意加入靛基質試劑後不可再振動，以防止破壞乙醚層，影響觀察結果。將靛基質試驗反應結果記錄圖4中。

圖4

硫化氫試驗

1、原理

硫化氫試驗是檢測硫化氫的產生，也是用於腸道細菌檢查的常用生化試驗。某些微生物能產生脫氨酶，使含硫胺基酸(如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等)脫去氨基，產生硫化氫氣體，在培養基中加入檸檬酸鐵銨或醋酸鉛，硫化氫與培養基中的鉛鹽或鐵鹽作用，生成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉澱物，此現象稱為硫化氫試驗陽性反應，如果沒有黑色沉澱物產生，即為硫化氫試驗陰性反應。產氣腸桿菌為硫化氫試驗陽性，大腸桿菌為硫化氫試驗陰性。

該試驗採取穿刺接種方法，因為醋酸鉛培養基中的硫代硫酸鈉為還原劑，能保持還原環境，使硫化氫不至於被氧化。如果所供給的氧氣能滿足細胞代謝，就不會產生硫化氫，因此，此試驗不能採用通氣過多的培養方式，如斜面培養，如圖5。

圖5

2、步驟

(1)製備醋酸鉛柱狀培養基

配方：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基100.0mL(pH 7.4)、硫代硫酸鈉0.25g、10%醋酸鉛水溶液1.0mL。

配製：將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基100mL加熱溶解，待其冷卻至60℃時加入硫代硫酸鈉0.25g，調至pH 7.2，趁熱分裝於三角瓶中，115℃滅菌15min。取出後待冷卻至55～60℃時，在無菌操作下，加入無菌的10%醋酸鉛水溶液1mL，混勻後趁熱分裝無菌試管中，每管高度4～5cm，然後立即置於冷水中冷卻凝固。

(2)製備大腸桿菌、產氣腸桿菌的斜面培養物。

(3)取醋酸鉛柱狀培養基9管，留3管作對照(不接菌)，其餘6管分2組分別接種大腸桿菌和產氣腸桿菌，並採取穿刺接種方法，每組接種3管，再用凡士林封住管口。

(4)將以上9管置於37℃恆溫箱內培養2～5d。

(5)每天觀察記錄，如果穿刺線周圍變黑，即為陽性反應，不變者為陰性反應。將硫化氫試驗反應結果記錄圖6中。

圖6

糖發酵試驗

1、原理

細菌具有分解不同糖類、醇類、苷類的酶，因而分解各種糖類、醇類、苷類的能力不同。常用於鑑定細菌糖發酵能力的單糖有葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露糖等：雙糖有蔗糖、麥芽糖、乳糖等；多糖有澱粉、糊精、棉籽糖等；醇類有甘露醇、肌醇、甘油等；苷類有水楊苷、松柏苷等。

根據細菌分解利用糖能力的差異表現出是否產酸產氣作為鑑定菌種的依據。鑑定細菌是否產酸，可以在糖發酵培養基中加入溴甲酚紫指示劑(即B.C.P指示劑)或溴麝香草酚藍指示劑。溴甲酚紫指示劑的變色範圍pH 5.2(黃色)～6.8(紫色)，即pH 5.2以下呈黃色，pH 6.8以上呈紫色，由紫遇酸變黃；溴麝香草酚藍指示劑的變色範圍pH 6.0(黃色)～7.6(藍色)，即pH 6.0以下呈黃色，pH 7.6以上呈藍色，由藍遇酸變黃。經培養後，根據指示劑的顏色變化來判斷培養液的酸鹼性。鑑定細菌是否產氣，可以在糖發酵培養基中放入倒置的杜氏小管觀察是否有氣體產生。如果細菌能分解糖產酸，即為陽性反應，用“+”表示：不能分解糖不產酸，即為陰性反應，用“一”表示。細菌能分解糖產酸並產氣，即為陽性反應，用“⊕”表示；不能分解糖不產氣，即為陰性反應，用“Θ”表示。

2、步驟

(1)製備糖發酵培養基。用此方法分別配製葡萄糖、蔗糖、乳糖發酵培養基。在糖發酵培養基中放入倒置的杜氏小管，見圖7。

圖7

(2)製備菌種製備大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形桿菌的斜面培養物。

(3)試管標記分別取葡萄糖、蔗糖、乳糖發酵培養基各4管，將每種糖發酵培養基的4支試管分別標記大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形桿菌和空白對照。

(4)接種培養在無菌操作下，分別挑取少量大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形桿菌的斜面菌種，接種到以上對應的糖發酵培養基試管中，空白對照不接菌。然後置於37℃恆溫箱內培養2～3d，如果反應遲緩需培養14～30d。

(5)觀察記錄，如果培養液保持原有顏色，即為陰性反應，表明該細菌不能分解該種糖類，記錄用“一”表示：如果培養液變為黃色，即為陽性反應，表明該細菌能分解該種糖類，記錄用“+”表示。如果培養液中杜氏小管內有氣泡，即為陽性反應，見圖8，表明該細菌能分解該種糖類產酸並產氣，記錄用“⊕”表示；如果杜氏小管內沒有氣泡，即為陰性反應，表明該細菌不能分解該種糖類不產氣，記錄用“Θ”表示。將糖發酵試驗反應結果記錄圖9中。

圖8

圖9

澱粉水解試驗

1、原理

澱粉水解試驗是測定澱粉是否被水解。有些微生物可產生澱粉酶，將澱粉分解成麥芽糖和葡萄糖，再被微生物作為碳源利用。例如根霉、麴黴可產生葡萄糖澱粉酶，巨大芽孢桿菌可產生β一澱粉酶，枯草桿菌可產生α一澱粉酶。澱粉水解成糊精時，遇碘變為藍色；例如澱粉被細菌水解以後，遇碘不再變為藍色，表明細菌產生澱粉酶。

2、步驟

(1)製備澱粉培養基

配方：可溶性澱粉20.0g、硝酸鉀1.0g、氯化鈉0.5g、磷酸氫二鉀0.5g、硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)0.1g、瓊脂20.0g，蒸餾水1 000.0mL，pH 7.2～7.4。

配製：先用少量水將澱粉調成糊狀，然後微火加熱，邊攪拌邊加水及其他成分，全部溶化後補足水分至1000.0mL，調pH，分裝於三角瓶中，0.1 MPa高壓滅菌20min。

(2)配製碘液

配方：碘片1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL。

配製：先用3～5mL水溶解碘化鉀，再加入碘片，待碘全部溶解後，加水稀釋至300mL。

(3)製備菌種製備大腸桿菌、產氣腸桿菌、枯草桿菌的斜面培養物。

(4)製備澱粉平板培養基在水浴鍋中將澱粉培養基融化，待冷卻至約46℃，在無菌操作下倒入無菌培養皿中，每皿15～20mL，待其凝固，即為澱粉平板培養基。如果平板培養基表面潮濕，可置於55℃溫箱中，20min後取出接種。

(5)接種取9個澱粉平板培養基，分3組分別接種大腸桿菌、產氣腸桿菌和枯草桿菌，每組接種3個平板。

(6)培養將以上9個平板倒置於30℃恆溫箱內培養2～5d。

(7)觀察結果當平板上出現菌落後，取出，在菌落上滴加碘液，使其布滿菌落表面。10min後，觀察菌落周圍是否仍呈藍色。有水解澱粉能力的細菌，在菌落周圍出現無色透明圈，說明澱粉已被細菌分解；透明圈越大，說明澱粉酶活性越強。沒有水解澱粉能力的細菌，整個菌落表面均為藍色。將澱粉水解試驗反應結果記錄下表中。此方法僅可作為定性或半定量的對比試驗，如圖10。

圖10

檸檬酸鹽試驗

1、原理

檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌(如產氣腸桿菌)能利用檸檬酸鈉作為碳源，有些細菌(如大腸桿菌)不能利用檸檬酸鹽。因此，可利用檸檬酸鹽試驗區分大腸桿菌和產氣腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養基中的磷酸銨(作為氮源)後，產生鹼性化合物，使培養基的pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，培養基由綠色變為藍色。溴麝香草酚藍指示劑的變色範圍pH 6.0(黃色)～7.6(藍色)，過渡顏色是綠色，pH 6.0以下呈黃色，pH 6.0～7.0呈綠色，pH 7.6以上呈藍色。檸檬酸鹽試驗反應培養基由綠色變為藍色，即為陽性反應(用“+”表示)，表明檸檬酸鹽被利用：培養基仍呈綠色，即為陰性反應(用“一”表示)，表明檸檬酸鹽沒有被利用。產氣腸桿菌為陽性反應，大腸桿菌為陰性反應。

2、步驟

(1)製備檸檬酸鹽斜面培養基

配方：磷酸二氫銨1.0g、磷酸氫二鉀1.0g、氯化鈉5.0g、硫酸鎂0.2g、檸檬酸鈉2.0g、瓊脂15.0～20.0g、蒸餾水1 000.0mL、1%溴麝香草酚藍乙醇溶液10.0mL，pH 6.8。

配製：將配方中各成分(除溴麝香草酚藍乙醇溶液以外)溶解後，調pH 6.8，然後加入溴麝香草酚藍乙醇溶液，搖勻，用脫脂棉過濾，分裝試管，製成的培養基呈黃綠色。注意配製時控制好pH，不要過鹼，以黃綠色為準。121℃高壓滅菌20min，趁熱擺成斜面。

(2)製備菌種製備大腸桿菌、產氣腸桿菌、枯草桿菌的斜面培養物。

(3)取檸檬酸鹽斜面培養基12管，留3管作對照(不接菌)，其餘9管分3組分別接種大腸桿菌、產氣腸桿菌和枯草桿菌，每組接種3管。

(4)將以上12管置於37℃恆溫箱內培養2～5d。

(5)觀察記錄，如果檸檬酸鹽斜面培養基上有細菌生長，並且培養基由綠色變為藍色，即為陽性反應(記錄用“+”表示)：如果培養基仍呈綠色，即為陰性反應(記錄用“一”表示)。將檸檬酸鹽試驗反應結果記錄圖11中。

圖11