《水稻抗褐飛虱基因及其套用》提供了水稻抗褐飛虱基因Bph14，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其cDNA序列如SEQ ID No.2所示，該發明Bph14基因屬於CC-NBS-LRR基因家族，編碼的蛋白質與植物抗病性相關。Bph14基因具有抗褐飛虱的功能，通過遺傳轉化和雜交，將Bph14基因轉入普通水稻品種，能夠提高水稻對褐飛虱的抗性，從而減輕褐飛虱產生的危害，達到增產和穩產的目的。
水稻抗褐飛虱基因的研究始於20世紀70年代初。截至2009年1月已命名了19個主效抗蟲基因（具體綜述見Yang HY等，2004 High-resolution genetic mappingat the Bph 15 locus for brown planthopper resistance in rice.Theor Appl Genet.110：182-191）。其中，Mudgo、CO22和MTU15三份材料的抗性受到一個顯性基因的控制，該基因被命名為Bph1，而另一個與Bph1緊密連鎖的隱性基因bph2控制著ASD7的抗性。Lakshminarayana和Khush在對28個品種的遺傳學研究中發現Rathu Heenati攜帶一個顯性抗褐飛虱基因Bph3，這一基因獨立於Bph1遺傳，此外Babawee中有一個隱性基因bph4，這個基因也獨立於bph2遺傳。Sidhu和Khush發現Bph3與bph4是緊密連鎖的，bph4還與半矮化基因sd-1連鎖。Khush等對ARC10550的遺傳分析證明它含有隱性基因bph5。Kabir和Khush在對17份抗生物型4但對其它三種生物型敏感的材料的研究中發現，Swamalata、T12分別含一個抗蟲基因，命名為Bph6和bph7。bph8、Bph9的發現與其它幾個基因類似，隱性基因bph8與bph2、bph4不等位，顯性基因Bph9與Bph3、Bph4不等位。上述抗褐飛虱基因中，bph5、Bph6、bph7褐飛虱抗生物型4，而對生物型1、2、3均表現為敏感。野生稻資源中有大量的抗褐飛虱材料。1994年Ishii等從澳洲野生稻（O.australiensis）的一個轉育系IR65482-4-136-2-2中鑑定出一個新的顯性抗褐飛虱基因Bph10，這個基因抗褐飛虱生物型1、2、3。從O.eichinger中鑑定出Bph11。帶有褐飛虱基因的水稻能抑制褐飛虱的取食、生長發育和繁殖，從而達到抗蟲的目的（Hao PY等，2008 Herbivore-inducedcallose deposition on the sieve plates of rice：an important mechanism for hostresistance.Plant Physiology 146：1810-1820）。但截至2009年1月尚未克隆到水稻的抗褐飛虱基因。
圖位克隆（map-based cloning）又稱為定位克隆（positional cloning），是隨著分子標記遺傳連鎖圖譜的發展而發展起來的一種基因克隆技術。圖位克隆法步驟包括對目標基因進行遺傳定位、物理定位、序列分析及遺傳轉化驗證功能。從理論上講，任何一個能定位的基因都可用圖位克隆法分離。圖位克隆法一般適合於基因組比較小的物種，如單子葉模式植物水稻，具有基因組小、基因組物理距離與遺傳距離之比小而且標記豐富的特點。水稻作為禾本科模式植物，其基因組是麥、高梁等七種禾本科植物基因組組成的同心圓的圓心，是最適合套用圖位克隆法分離目的基因的作物之一。水稻中已經克隆的多個基因都是通過圖位克隆法克隆的，如抗白葉枯病基因Xa-21（Song WY等1995，A Receptor Kinase-Like Protein Encoded by theRice Disease Resistance Gene，Xa21.Science，270：1804-1806）、Xa-1（Yoshimura等1998，Expression of Xa-1，a bacterial blight-resistance gene inrice，is induced by bacterial inoculation.PNAS，95：1663-1668）和Xa-26（Sun等2004，Xa26 a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzaein rice，encodes an LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal，37：517-527），抗稻瘟病基因Pi-b（Wang等1999，The Pi-b gene for rice blastresistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class ofplant disease resistance genes.Plant Journal，1999，19：55-64）和Pi-ta（Bryan等2000，A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptiblealleles of the rice blast resistance gene Pi-ta.Plant Cell，12：2033~2046），以及中國科學家克隆的分櫱基因（Li等2003，Control of tillering in rice.Nature422：618-621）、耐鹽基因（Ren等2005，A rice quantitative trait locus for salttolerance encodes a sodium transporter.Nature Genetics 37（10）：1141-1146）和高產基因（Weiya Xue等2008，Natural variation in Ghd7 is an importantregulator of heading date and yield potential in rice.Nature Genetics 40，761-767）。
《水稻抗褐飛虱基因及其套用》Bph14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該基因全長9921bp，具有1個內含子和2個外顯子，其CDS分別為區段分別為3387-7289和7936-8004，cDNA全長3972bp，編碼1323個胺基酸，其蛋白序列如序列表SEQ ID NO.3所示。該蛋白屬於NBS-LRR家族，活性中心180-464區段為保守的NB-ARC區，包括保守的P-loop，ATP結合區，激酶1a等。
在不影響Bph14蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），技術人員可對SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個胺基酸獲得具有同等功能的胺基酸序列。
植物高分子量基因組DNA的製備參照張洪斌等的方法（Zhang等，Preparation of megabase DNA from plant nuclei.Plant J 1995，7，175-184）。提取抗褐飛虱水稻B5（Wang BN，Huang Z，Shui LH，Ren X，Li XH，He GC（2001）Mapping of two new brown planthopper resistance genes from wild rice.Chinese Science Bulletin 46：1092-1095）的嫩葉細胞核，用低熔點瓊脂糖包埋。將包埋塊加入適量的限制性內切酶BamHI進行部分酶切，用CHEFMapper脈衝電泳儀進行交變脈衝電泳分離所需片段。切下含所需大片段區域的最濃部分的膠條放入透析袋中，電泳透析回收所需的DNA大片段（Strong等，Marked improvement of PAC and BAC cloning is achieved usingelectroelution of pulsed-field gel-separated partial digests of genomic DNA.Nucleic Acids Res.1997，25，3969-3961）。電透析分離的大片段DNA被收集到1.5ml離心管中，按600納克回收的DNA片段（50-250千鹼基對）與200納克的BIBAC2脫磷載體混合在60攝氏度加熱10分鐘冷卻至室溫，加入T4DNA連線酶，在16攝氏度下連線16小時。取2微升連線產物和40微升DH10B感受態細胞用GenePulser System進行電擊轉化，37攝氏度培養過夜。挑取上述平板上長出的陽性菌落到含有70微升培養液的384孔細胞培養板中，37攝氏度培養30小時。文庫構建完畢，用Genetix Q-PIX拷貝兩份，-80攝氏度保存。為了估算插入片段大小和克隆體積的分布情況，從文庫中隨機挑取30個BIBAC克隆，按鹼裂解法提取質粒，用適量的NotI酶切後，脈衝電泳檢測插入片段的大小（Shi ZY，Ren X，Weng QM，Li XH，He GC（2003）Construction of genomic library of aBPH-resistant rice line with binary vector and physical map of Qbp1 locus.Plant Science 1165：879-885）。
4.SM1-G1318區段物理圖譜的構建
篩選出R1925-G1318區段所有的BAC克隆，用BamHI和EcoRI雙酶切後電泳、轉膜。再將酶切後的克隆末端用放射性α-p-dCTP標記，與BAC克隆膜進行Southern雜交，方法同前，根據雜交信號判斷哪些BAC克隆有重疊以及重疊片段的大小，以此構建物理圖譜（圖3C）。BAC陽性克隆末端分離參照劉耀光等（Liu and Whittier，Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 andYAC clones for chromosomewalking.Genomics 25：674-681）發明的TAIL-PCR方法。篩選以及TAIL-PCR結果顯示BAC克隆76B10包含了完整的Bph14基因（圖3C）。
以預測基因所對應的EST作探針，對褐飛虱誘導的抗蟲水稻B5 cDNA文庫（Wang XL，Weng QM，You AQ，Zhu LL，He GC（2003）Cloning andcharacterization of rice RH3 gene induced by brown planthopper.ChineseScience Bulletin 48：1976-1981）進行噬菌體原位雜交篩選。經過三輪原位雜交，將挑選的單個噬斑PCR檢測，再酶切檢測插入片段的大小，測序分析得到Bph14的全長cDNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
實施例2：Bph14基因的功能驗證和套用
1.遺傳轉化載體的構建
所用載體為pCAMBIA1301（購自澳大利亞Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture）。根據基因組測序的結果，設計引物（5’cggaattcctccctgactgaagaagagaagag3’，5’cggaattctgctagctgtgattctcttatgatg3，），其包括EcoRI的接頭，擴增抗蟲水稻B5的基因組（Z.Huang等，Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice.Theor Appl Genet，2001，102：929-934）。PCR反應總體積50微升：1微升DNA，5微升10×buffer，1微升10毫摩爾/升dNTP，10微摩爾/升引物各3微升，高保真Taq酶1U；反應程式：94攝氏度2分鐘，94攝氏度15秒，58攝氏度30秒，72攝氏度7分鐘30秒，共30個循環；產物加1/10體積的3毫摩爾/升NaAC和2×體積的無水乙醇純化。所得序列包括Bph14上游1960bp的啟動子、4997bp的基因組序列以及下游436bp的3’非翻譯區。用EcoRI酶切，酶切反應體系總體積為20微升：PCR產物約5μ1（1微克）、1×反應緩衝液、EcoRI1U，混勻後37攝氏度酶切過夜，1/10體積的3毫摩爾/升NaAC和2×體積的無水乙醇沉澱，回收所需片段。pCAMBIA1301載體酶切體系同上，試劑盒純化回收。連線反應：基因組片段1微升，載體0.5微升，2U T4 ligase，5×buffer 2微升，總10微升體積，4攝氏度連線過夜；連線產物與大腸桿菌DH10B混勻，42攝氏度熱激90秒，加400微升LB，復甦45分鐘，取200微升塗於含卡那黴素的LA平板，37攝氏度，過夜。挑單克隆，擴大培養，抽質粒，酶切驗證。挑陽性克隆，把構建好的載體電轉農桿菌EHA105，抽質粒，PCR驗證正確，取750微升含構建好載體的農桿菌菌液加等體積的50％甘油混勻，-70攝氏度保存。
採用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法（Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice（Oryza sativa L.）mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6：271-282）將上述Bph14基因組轉化載體和cDNA轉化載體分別導入褐飛虱感性的普通水稻品種Kasalath（購自中國國家水稻種質資源庫或國際水稻研究所），同時採用空載體（pCAMBIA1301）作對照。
3.Bph14基因表達的結果和套用
兩個轉化載體分別獲得的組培苗14株，對照4株。田間播種，分別收穫了T1代後，選擇純合株系（各14個株系）做抗蟲鑑定。經過苗期鑑定以及成熟期植株的抗蟲鑑定，轉基因植株對褐飛虱的抗性均明顯增強，而對照株不具有抗褐飛虱抗性。轉基因水稻苗期的抗蟲級別均在3-5級之間，成熟期的轉基因植株放蟲後存活良好，且能正常結實。同時，取食電位儀EPG（Peiying Hao et al，Herbivore-induced callose deposition on the sieveplates of rice：an important mechanism for host resistance.PlantPhysiol，2008，146：1810-1820）檢測褐飛虱取食轉基因植株時，韌皮部的取食時間明顯減少；蜜露量（P.Paguia，Honeydew excretion measurement techniques fordetermining differential feeding activity of biotype of Nilaparvata lugens onrice varieties.J.Econ.Entomol，1980，73：35-40）的檢測證實了褐飛虱取食轉基因植株時的排泄量減少。因此，克隆得到的Bph14能使水稻對褐飛虱的取食產生抗性。
序列表說明：SEQ ID No.1是Bph14基因的核苷酸序列，SEQ ID No.2是其cDNA序列，SEQ ID No.3是其編碼的蛋白序列；SEQ ID No.4&5以及SEQ ID No.6&7是用於從B5基因組中擴增Bph14基因的引物對；SEQ ID No.8&9是用於擴增Bph14基因的cDNA的引物對；SEQ ID No.10&11是用於從pCAMBIA1301中擴增35S啟動子的引物對；SEQ ID No.12&13是Bph14基因的標記引物。
