新型冠狀病毒的實時螢光定量檢測虛擬仿真實驗

新型冠狀病毒的實時螢光定量檢測虛擬仿真實驗是暨南大學建設的虛擬仿真實驗課程、實驗空間平台第二批虛擬實驗教學課程共享專題課。該課程在實驗空間平台授課，課程負責人是王峰，授課教師是周光雄、孫晗笑、張志民、江正瑾。據2021年12月實驗空間官網顯示，該課程做實驗人數1144，其中優秀382人、達標296人、不達標142人，實驗完成率為77%、實驗通過率74.3%。

該課程藉助虛擬仿真技術使學生沉浸在虛擬環境中自主進行實驗，幫助學生掌握咽拭子取樣、RNA提取、逆轉錄、引物設計、螢光定量PCR等核心知識內容，培養更全面的生物醫藥人才。

基本介紹

• 中文名：新型冠狀病毒的實時螢光定量檢測虛擬仿真實驗
• 類別：虛擬仿真實驗課程、實驗空間第二批虛擬實驗教學課程共享專題課
• 課程負責人：王峰
• 建設院校：暨南大學
• 授課教師：周光雄、孫晗笑、張志民、江正瑾
• 授課平台：實驗空間

課程建設

2016年1月，經教育部、財政部批准，暨南大學生命科學與技術實驗教學中學成立（國家級實驗教學示範中心）。2017年，暨南大學藥學學科入選國家雙一流建設學科，為該虛擬實驗課的教學提供了教學平台。

2020年4月18日，暨南大學開發了新型冠狀病毒的實驗螢光定量檢測虛擬仿真實驗教學軟體V1.0，

2020年5月6日，新型冠狀病毒的實驗螢光定量檢測虛擬仿真實驗教學軟體V1.0首次發布。

課程性質

課程背景

對於該虛擬仿真實驗課的實驗必要性及實用性來講：

第一，實驗內容具有高實用性。病毒的採集、檢測和實時螢光定量PCR技術廣泛套用於實驗研究、臨床檢測中，是生物技術藥物學實驗、細胞與分子生物學等課程的經典教學內容，是生物製藥、生物工程、藥學、醫學類各專業學生需要掌握的實驗技術。

第二，實驗對象特殊。該項目實驗涉及到病毒樣本的提取等操作，而在實際操作過程中存在新型冠狀病毒對人有高傳染性，強致病性；實驗過程可能涉及的患者隱私；患者和醫生不能完全配合病毒取樣等問題，而該虛擬仿真項目依託虛擬現實構建高度仿真的虛擬實驗對象，避免學生與患者直接接觸，能有效的保護患者的隱私和操作者的安全。

第三，實驗環境匱乏。新型冠狀病毒的取樣及檢測需在高級別生物安全實驗室中進行，而絕大多數學校的實驗環境無法滿足新冠病毒的取樣和檢測的要求，而該虛擬仿真項目採用三維仿真技術進行製作，利用3D max軟體在器械、場景設備細節表現方面的優勢，進行生物安全實驗室、醫療器械等設備模型的搭建，完美地重現高級別生物安全實驗室環境，有效解決了驗環境的匱乏所帶來的困難，使學生沉浸在虛擬環境中自主進行實驗，給學生提供專業的指導。

第四，實驗設備和材料價格昂貴，實驗周期較長。對於傳統教學方式來說，螢光定量PCR儀的價格昂貴，且病毒螢光定量檢測的實驗周期相對較長，無法滿足大批量學生同時進行實驗操作的需求，難以開展。而該實驗項目藉助Unity3D 高端虛擬現實引擎、Visual Studio、C#程式語言編譯虛擬仿真互動程式和搭建虛擬仿真三維場景，讓操作者模擬在各樣實驗設備仿真模型上的操作，解決了實驗器材匱乏的問題。

病毒的採集和檢測是生物工程類專業學生需要掌握的重要知識內容和技能。而由於病毒具有高致病性和強傳染性、取樣及檢測對環境要求高、臨床資源有限且涉及患者隱私、qPCR儀器和試劑價格昂貴等原因難以滿足大規模學習的需求。因此，該虛擬仿真實驗課教學團隊開發了暨南大學新型冠狀病毒的實時螢光定量檢測虛擬仿真實驗課程。

適應專業

該虛擬仿真實驗課適應生物工程類及生物製藥類專業進行學習。

課程簡介

實驗原理

流程圖：咽拭子在病人咽喉後壁採集樣本→RNA提取試劑盒從病人樣本中提取RNA→逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉成cDNA→螢光定量qPCR

（1）逆轉錄實驗原理

反轉錄是以RNA為模板，通過反轉錄酶合成DNA的過程，是DNA生物合成的一種特殊方式。反轉錄是在進行基因工程過程中，以RNA為模板提取出DNA遺傳信息的過程。反轉錄過程由反轉錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。在反轉錄酶的作用下，用組織細胞提取mRNA並以它為模板，合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構建出cDNA文庫，從中篩選特異的目的基因，是最常用的獲得目的基因的方法。

（2）引物設計的原則

引物設計有三條基本原則：

1、引物與模板的序列要緊密互補；

2、引物與引物之間要避免形成穩定的二聚體或髮夾結果；

3、引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應（即錯配）

除引物設計的三條基本原則外，引物設計還需考慮諸多因素，如引物長度、產物長度、序列的解鏈溫度（Tm值）、引物與模板形成雙鏈的內部穩定性（用△G值反應）、引物及產物的GC含量等，必要時還可對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點、引進突變等。

（3）qPCR實驗原理

在qPCR反應體系中，加入SYBR螢光染料，SYBR螢光染料會特異性地摻入DNA雙鏈而發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。所以當病人樣本中含有檢測病毒DNA時，隨著DNA的複製，這個螢光信號值會被擴大，從而被儀器檢測到。

qPCR實驗原理

知識內容

該實驗課程共包含9個知識點：1. 新型冠狀病毒等五種呼吸道病毒的結構以及傳播方式；2. RNA提取的操作；3. RNA逆轉錄的操作；4. NCBI網站的使用；5. Primer 引物設計以軟體的使用；6. 引物設計所遵循的原則；7. 螢光定量PCR加樣順序原則；8. SYBR Green螢光標記技術的原理；9. 螢光定量PCR的基本操作。

課程步驟

實驗方法

利用虛擬仿真實驗模組，通過虛擬操作新型冠狀病毒等五種病毒的螢光定量檢測虛擬仿真實驗,在虛擬操作過程中，會根據實驗步驟設計以下幾個部分：知識點提示對話框，錯誤提示警告與正確示範，注意事項對話框，關鍵知識點選擇題，將教學內容貫徹到虛擬操作的全過程。

實驗步驟

具體步驟

第1步：實驗前病毒預習模式

學生通過滑鼠拖動病毒相應結構名稱和病毒拼圖放在相應位置，放置正確得分，放置錯誤不得分。

第2步： 實驗防護裝備的選擇

學生點選實驗所需要的個人防護裝備，對虛擬人員進行穿戴，穿戴正確後台記錄得分，錯誤選擇不得分。選擇錯誤系統給出提示，直到選擇正確後實驗才可繼續。

實驗防護裝備的選擇

第3步：在患者咽喉後壁採集

學生用滑鼠拖動棉簽，在圖中標註位置進行模擬採樣，採樣正確後台記錄得分，錯誤採樣不得分，且採樣錯誤會導致後面實驗結果呈假陰性。

具體步驟：

1. 囑病人張口發“啊”音，暴露咽喉（必要時用壓舌板將舌壓下）。

2. 取出培養管中的拭子輕柔、迅速的擦拭兩齶弓、咽及扁桃體→試管口在酒精燈火焰上消毒。

3. 將拭子插入試管中，塞緊瓶塞。

4. 冷凍保存取好的樣品，或者立即進行檢驗。

注意事項：

1. 採集標本時，方法應正確，注意培養瓶口消毒，保持容器無菌，以免影響檢驗結果。

2. 採集動作應輕柔，以免刺激病人咽部引起嘔吐或不適。

第4步：樣品凍存

學生利用鍵盤方向鍵按地面指示進入P3實驗室，將樣本凍存在超低溫冰櫃。

第5步：超淨工作檯消毒處理

打開超淨工作檯電源，並打開工作檯紫外燈開關，對工作檯進行半小時消毒處理。

超淨工作檯消毒處理

第6步：樣品RNA的提取（在實驗室負壓區進行）

1. 取出待測樣本以及試劑盒陰性對照後。用移液器將20 μl Proteinase K加入一個乾淨的1.5 ml離心管中。

樣品RNA的提取（在實驗室負壓區進行）

2. 向樣品中加入200 μl Carrier RNA工作液。蓋上管蓋，渦旋振盪15 sec混勻。（注意：為了保證裂解充分，樣品和Carrier RNA工作液需要徹底混勻。）

3. 在56℃孵育15 min。短暫離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。

4. 加入250 μl無水乙醇，此時可能會出現絮狀沉澱。蓋上管蓋並渦旋振盪15 sec，徹底混勻。在室溫（15-25℃）放置5 min。

樣品RNA的提取（在實驗室負壓區進行）

5. 短暫離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。

6. 仔細將離心管中的溶液和絮狀沉澱全部轉移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），蓋上管蓋，8,000 rpm (~6,000×g) 離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。（注意：如果吸附柱上的液體未能全部離心至收集管中，請加大轉速，延長離心時間至液體完全轉移到收集管中。）

樣品RNA的提取（在實驗室負壓區進行）

7. 小心打開吸附柱蓋子，加入500 μl緩衝液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 蓋上管蓋， 8,000 rpm (~6,000×g)離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。

樣品RNA的提取（在實驗室負壓區進行）

8. 小心打開吸附柱蓋子，加入600 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 蓋上管蓋，靜置2 min，8,000 rpm (~6,000×g)離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。

9. 重複步驟8。

10. 小心打開吸附柱蓋子，加入500 μl無水乙醇，蓋上管蓋，8,000 rpm (~6,000×g)離心 1 min，棄廢液。 注意：乙醇的殘留可能會對後續實驗造成影響。

11.將吸附柱放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g)離心3 min，使吸附膜完全變乾，棄廢液。

12.將吸附柱放入一個RNase-Free離心管（1.5 ml）中，小心打開吸附柱的蓋子，室溫放置3 min，使吸附膜完全變乾。向吸附膜的中間部位懸空滴加20-150 μl RNase-Free ddH₂O，蓋上蓋子，室溫放置5 min。12,000 rpm (~13,400×g)離心1 min。 (注意：確保洗脫液（RNase-Free ddH₂O）在室溫平衡後再使用。如果加入洗脫液的體積很小（小於50 μl），為了將膜上的RNA充分洗脫下來，應注意將洗脫液加到膜的中央位置。洗脫體積可以根據後續的實驗要求靈活處理。

第7步：RNA逆轉錄

1. 殘留基因組DNA 去除

在RNase free 離心管中配製如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2min。

2. 逆轉錄反應體系配製（20 μL 體系）

在上一 步的反應管中直接加入4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus，用移液器輕輕吹打混勻。

逆轉錄反應體系配製（20 μL 體系）

3. 逆轉錄程式設定

逆轉錄程式設定

註：逆轉錄溫度：推薦使用55℃。對於高GC 含量模板或者複雜模板，可將逆轉錄溫度提高到60℃。

※ 逆轉錄產物可立即用於qPCR 反應，也可-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝後，於-80℃保存，避免反覆凍融。

第8步：NCBI獲取病毒基因序列

打開NCBI網頁，輸入新冠病毒名稱點擊查詢，根據選項選擇相應病毒選項。點擊進入，打開病毒基因序列，提示獲取新冠病毒基因序列。

第9步： 利用軟體進行引物設計

打開primer5.0引物設計軟體，將所得到的病毒序列輸入其中，點擊引物設計，通過比較引物的GC含量，是否有引物二聚物，是否有錯配等信息，選擇合適的引物。

利用軟體進行引物設計

第10步：PCR反應液的配置

1. 在8聯管的一端編號，防止將樣品順序混淆。

2. 按照下表配製 PCR 反應液。（全程避光操作）

PCR反應液的配置

3. 離心將反應液收集到管底後迅速放在冰上。

PCR反應液的配置

第11步：打開螢光定量PCR儀，登錄賬號密碼，進入程式操作界面

打開螢光定量PCR儀，在顯示的界面，根據提示手動輸入賬號和密碼，輸入完成後，點擊確認，進入到程式操作界面。

程式操作界面

第12步：添加四個反應程式，設計反應參數

在程式設定界面設定反應染料類型，並設定反應體積，點擊添加程式按鈕，手動添加Prevarition（預變性），Amplification（擴增），Melting（熔解曲線），Cooling（冷卻）四個主反應程式。

設計反應參數

第13步：設定Prevarition（預變性）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數

點擊Prevarition（預變性）程式，設定Prevarition（預變性）的循環數，反應溫度，反應時間。循環數設定為1，反應溫度為95℃，反應時間為5 min。程式如下：

cycles：1 , Target： 95℃ ，Acquisition Mode： None Hold ：5min

設定Prevarition（預變性）反應程式的溫度，反應時間

第14步：設定Amplification（擴增）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數

點擊Amplification（擴增）程式，設定Amplification（擴增）的循環數，及變性，退火，延伸反應的溫度，反應時間。程式參數如下：

cycles：40 ,

Target： 95℃ ，Acquisition Mode： None Hold ：10s

Target：60℃ , Acquisition Mode： Single Hold ：30s

設定Amplification（擴增）反應程式的溫度，反應時

第15步：設定Melting（熔解曲線）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數

點擊Melting（熔解曲線）程式，設定Melting（熔解曲線）的循環數，反應溫度，反應時間。程式如下：

cycles：1

Target： 95℃ ，Acquisition Mode： continue Hold ：15s

Target：65℃ , Acquisition Mode： continue Hold ：1min

設定Melting（熔解曲線）反應程式的溫度，反應時間，循環

第16步：設定Cooling（冷卻）反應程式的溫度

點擊Cooling（冷卻）程式，設定Cooling（冷卻）的循環數，反應溫度，反應時間。程式如下：

cycles：1

Target： 4℃ ，Acquisition Mode： None Hold ：1min

設定Cooling（冷卻）反應程式的溫度

第17步：樣本名稱編輯

點擊左邊的“sample editor”，輸入相應樣品名稱

樣本名稱編輯

第18步：樣本Ct值的輸出

依次點擊儲存按鈕， “report” 按鈕， “generate” 按鈕，

“PDF” 按鈕，（即生成相應的PDF的檔案，PDF中有每個孔對應的Ct值）

樣本Ct值的輸出

第19步：根據樣本Ct值判斷患者是否含有新冠肺炎病毒

得到樣本Ct值，將Ct值與判斷標準進行比對以得出結果。

根據樣本Ct值判斷患者是否含有新冠肺炎病毒

以上實驗步驟參考資料：

結論要求

根據實驗所得到的曲線分布的情況，得到樣本CT值，若無CT值或CT>40為陰性，CT<37判為陽性。CT值在37-40之間。建議重複實驗，若重做實驗CT值<40，判為樣品位陽性，否則為陰性。

結論要求

1.在患者咽喉後壁採集樣本時，採樣位置錯誤會導致後面實驗結果呈假陰性。

2.學生將樣本凍存在超低溫冰櫃時，樣品處理、凍存不當會使得樣本降解，導致結果成假陰性。

3.超潔淨工作檯紫外消毒不徹底，可能會使後續樣本造成交叉污染，使得結果成假陰性或假陽性。

4.RNA提取操作中，使用75%乙醇洗滌時，洗滌少於兩次及洗滌後沒有揮乾乙醇會導致提取RNA不純，在最後使用無RNA酶水溶解RNA時，無RNA酶水體積過大會導致RNA濃度降低，無RNA酶水體積過少會導致RNA提起含量變低，以上都會導致檢測結果呈假陰性。

5.RNA逆轉錄步驟中殘留基因組DNA 去除不充分，導致DNA污染，使得結果呈假陽性。

6. 引物設計時，引物設計序列存在發卡結構，以會引物設計位點會發生錯配，會導致結果呈假陽性。設計引物的擴增產物大小需要控制在250-400bp，過短或過長會導致結果呈假陽性。

7.設定反應染料類型應為SYBR Green，設定錯誤會導致無法得到檢測結果。

8.設定擴增反應程式時，退火延伸階段檢測模式需要設定成Single以收集螢光信號，否則機器無法收集螢光信號，從而無法得到樣本Ct值。

9.設定熔解曲線反應程式時，變性及退火階段檢測模式需要設定成continue以持續收集螢光信號，否則機器無法收集螢光信號，導致無法得到樣本的熔解曲線，從而無法判斷結果的可靠性。

• 其他描述

通過以上兩個學時的學習，要求學生通過完成新型冠狀病毒等五種呼吸道病毒的螢光定量檢測虛擬仿真實驗學習，並且獨立完成虛擬仿真操作後，能夠理解每步的實驗原理與操作步驟。

課程特色

新型冠狀病毒等五種呼吸道病毒檢測虛擬仿真實驗系統採用三維仿真技術進行製作，利用3D max軟體在器械、場景設備細節表現方面的優勢，進行生物安全實驗室、醫療器械等設備模型進行搭建，結合MAYA軟體在模型動畫環境表現方面的特點，進行人物動作還原，通過Unity3D 高端虛擬現實引擎、Visual Studio、C#程式語言編譯虛擬仿真互動程式和搭建虛擬仿真三維場景，在計算機、虛擬現實頭盔、平板電腦等設備上實現新型冠狀病毒等五種呼吸道病毒檢測虛擬仿真實驗的各項功能：能夠完全將採集樣本和檢查試驗過程的醫療用品、患者、醫療操作手法及步驟，利用三維模型和三維動畫技術，全面、立體的展示出來，並且可以通過三維仿真平台，將模型以透視或剖視的角度實時展現。

通過虛擬互動，體驗者可以互動選取該次所需的實驗材料及儀器，還原更衣室、採集室、檢測室等相關環節場景，嚴格按照醫療標準設計虛擬環境下的醫療準備過程和步驟，在採集樣本過程中，支持從多個角度進行三維剖視，通過多種視角切換，讓體驗者能夠更加直觀地了解整個採集檢驗的醫療操作過程。同時可以使用多種醫療器具，模擬在虛擬患者身上的操作流程，也可以在各樣醫療設備仿真模型上進行對應操作，模擬操作qPCR 檢測新型冠狀病毒等五種病毒的引物設計、 qPCR 反應液的配置、標準曲線的制定、配置對照品DNA 溶液模板、進行 qPCR 反應製備標準曲線、將8連管置於螢光定量 PCR 儀中進行 qPCR 反應、設定 qPCR 反應條件，設定熔解曲線、qPCR 實驗結果分析、標準曲線分析等操作流程和設備功能，都能在虛擬仿真軟體中完整呈現，體驗者可以在多個模式，從多個方位，對每一步的虛擬仿真實驗操作進行實時查看和記錄回放。

教學設計

新型冠狀病毒是一種高危實驗對象，直接讓學生進行實際病毒操作具有安全隱患。而該虛擬仿真實驗能依託虛擬現實手段讓學生模擬這類實驗操作，能有效補充現實中實驗操作教學的不足，減少操作中的風險，保障學生健康。該虛擬仿真項目教學過程共分為預習、學習、考核三個階段。

預習階段

主要包括實驗原理介紹、呼吸道相關病毒背景知識、抗病毒藥物和防疫相關知識的學習。並藉助趣味病毒拼圖，以激發學習興趣，調動學生的學習熱情，幫助學習者更好鞏固所學內容。

學習階段

提供語音提示和文字指導，學生可根據提示進行操作練習。側重於讓學習者藉助該虛擬仿真項目，在人機互動的過程中依據系統的提示和引導自主學習並掌握新型冠狀病毒的結構，傳播方式， RNA提取的操作，RNA逆轉錄的操作，螢光定量PCR的基本操作等核心知識內容，在豐富學生專業能力的同時，提升學習者的自主學習能力。

考核階段

在學習者完成所有知識點的學習後，系統會有一次測試作為實驗的考試，為計分制，幫助教師掌握學生的學習情況。

教學目標

經過學習後學生應掌握以下能力：

1. 新型冠狀病毒的結構，傳播方式，治療藥物及防疫病毒相關知識；

2. RNA提取的操作；

3. RNA逆轉錄的操作；

4. NCBI網站獲取相關基因序列；

5. 引物設計所遵循的原則及Primer 引物設計軟體的使用；

6. SYBR Green螢光標記技術的原理；

7. 螢光定量PCR的基本操作。

考核標準

序號	步驟名稱（100字以內）	步驟目標要求（100字以內）	步驟合理用時（分鐘）	目標達成度賦分模型（200字以內）	步驟滿分
1	病毒相關知識的了解	完成病毒基本知識的了解，根據病毒的結構完成病毒拼圖操作題	5	3道病毒拼圖操作題，根據病毒的結構，利用滑鼠拖動選項，將正確的病毒結構名稱放在正確的病毒指示位置。拼圖正確得5分，錯誤得0分	15
2	實驗防護裝備的選擇	完全實驗防護裝備的穿戴	1	手動操作：利用滑鼠點擊相應的實驗防護裝備，拖動防護裝備給虛擬人員佩戴防護裝，佩戴正確得1分，錯誤得0分。 4道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在1mi內完成不扣分，逾時扣1分	5
3	在患者咽喉後壁採集	根據提示完成患者樣品採集	2	手動操作：分三步，點擊滑鼠拖動棉簽在虛擬人員口腔的正確部位完成取樣，3步共3分。操作正確一步得1分，錯誤操作得0分。 1道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在2 min內完成不扣分，逾時扣1分	4
4	將樣品進行凍存	根據提示完成樣品凍存	1	手動操作：根據地面指示進入P3實驗室，將樣本凍存在超低溫冰櫃。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 1道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在1mi內完成不扣分，逾時扣1分	2
5	超潔淨工作檯消毒處理	根據提示完成超潔淨工作檯消毒 根據提示選取正確試劑並加入相應離心管中	1	手動操作：根據指示打開超潔淨工作檯，打開紫外燈對超潔淨工作檯進行紫外消毒。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 1道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在40 s內完成不扣分，逾時扣1分	2
6	提取樣本RNA	根據提示完成樣本RNA提取	7	手動操作:共25步，根據提示點擊相應的試劑，將RNA工作液等試劑加入相應的離心管中,經過反應，離心，洗滌，收集等步驟以提取樣本RNA。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 時間控制：在7 min內完成不扣分，每逾時1分鐘扣1分，最多扣7分。	25
7	RNA逆轉錄	根據提示完成RNA逆轉錄	4	手動操作:共8步，根據提示點擊相應的試劑，將逆轉錄酶，無RNA酶水等試劑加入相應的離心管中，經過離心，恆溫孵育等相關步驟進行逆轉錄操作。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 3道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在4min內完成不扣分，每逾時1分鐘扣1分，最多扣4分。	11
8	NCBI獲取病毒基因序列	根據提示完成從NCBI網站上獲取病毒基因序列	5	手動操作:共5步，打開NCBI網頁，輸入新冠病毒名稱點擊查詢，根據網頁提示獲取新冠病毒基因序列。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	0
9	利用軟體進行引物設計	根據提示模擬引物設計	4	手動操作:共16步，根據提示打開primer5.0引物設計軟體，將獲得的病毒序列複製到軟體，進行引物設計。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 4道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在4 min內完成不扣分，每逾時1分鐘扣1分，最多扣4分。	20
10	PCR反應液的配置	根據提示完成PCR反應液的配置	5	手動操作:共7步，根據提示點擊相應的試劑，將PCR酶，特異性引物，逆轉錄所得cDNA等試劑加入相應的八連管中，配成PCR反應液。操作正確得1分，錯誤操作得0分。 1道選擇題：答對得1分，答錯得0分。 時間控制：在5 min內完成不扣分，每逾時1分鐘扣1分，最多扣5分。	8
11	打開螢光定量PCR儀，登錄賬號密碼，進入程式操作界面	根據提示完成螢光定量PCR儀的開啟和賬號登錄	1	手動操作:共5步，根據提示打開PCR儀器開關，手動輸入賬號及密碼，進入程式操作界面。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	5
12	添加四個反應程式，設計反應參數	根據提示添加螢光定量PCR儀四個反應程式，設計反應參數	1	手動操作:共4步，進行程式設定頁面，設定反應的類型，反應體積，且手動添加預變性，擴增，熔解，冷卻四個主反應程式。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	4
13	設定Prevarition（預變性）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	根據提示設定Prevarition（預變性）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	1	手動操作:共5步，設定Prevarition（預變性）的循環數，反應溫度，反應時間。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	5
14	設定Amplification（擴增）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	根據提示設定Amplification（擴增）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	1	手動操作:共6步，設定Amplification（擴增）的循環數，及變性，退火，延伸反應的溫度，反應時間。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	6
15	設定Melting（熔解曲線）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	根據提示設定Melting（熔解曲線）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	1	手動操作:共6步，設定Melting（熔解曲線）的循環數，反應溫度，反應時間。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	6
16	設定Cooling（l冷卻）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	根據提示設定Cooling（l冷卻）反應程式的溫度，反應時間，循環數等參數	1	手動操作:共5步，設定Melting（熔解曲線）的循環數，反應溫度，反應時間。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	5
17	樣本名稱編輯	進行樣品名稱編輯	1	手動操作:共3步，根據編輯每個樣本的名稱，方便分析樣本對應的Ct值。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	3
18	樣本Ct值的輸出	完成Ct值輸出	1	手動操作:共6步。根據提示點擊相應按鈕，生成反應結果報告，導出報告，根據樣本名稱找到對應樣本的Ct值。操作正確得1分，錯誤操作得0分。	6
19	根據樣本Ct值判斷患者是否含有新冠肺炎病毒	學會依據樣本Ct值判斷患者是否含有新冠肺炎病毒	1	得到樣本Ct值，將Ct值與判斷標準進行比對以得出結果。 2道選擇題：答對得1分，答錯得0分。	2

教師簡介

王峰，博士，暨南大學藥學院副研究員，碩士研究生導師。主要研究方向為基因工程藥物、靶點的挖掘利用及篩選平台構建。

周光雄，暨南大學藥學院藥理學教研室教師。

孫晗笑，暨南大學基因組藥物研究所主任、教授、博士研究生導師。

張志民，暨南大學藥學院藥物化學生物學研究所研究員。

江正瑾，博士，暨南大學教授，博士生導師及暨南大學藥物分析學科帶頭人。