《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》是中山大學達安基因股份有限公司於2020年3月10日申請的專利，該專利的公布號為CN111020064A，授權公布日為2020年4月17日，發明人是蔣析文、彭海龍、范建。該發明屬於生物技術和分子診斷領域。
《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》公開了一種檢測新型冠狀病毒的ORF1ab基因的試劑盒及方法，具有極高的靈敏度和特異性。
2021年11月，《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》獲得第八屆廣東專利獎金獎。
（概述圖為《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒
- 申請人：中山大學達安基因股份有限公司
- 申請日：2020年3月10日
- 申請號：2020101601627
- 公布號：CN111020064A
- 公布日：2020年4月17日
- 發明人：蔣析文、彭海龍、范建
- 地址：廣東省廣州市高新技術開發區香山路19號
- 分類號：C12Q1/70(2006.01)I、C12Q1/686(2018.01)I、C12N15/11(2006.01)I、C12R1/93(2006.01)N
- 代理機構：上海助之鑫智慧財產權代理有限公司
- 代理人：陳詳
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
2019年12月以來，陸續發現了多例不明原因肺炎病例，已證實為一種新型冠狀病毒感染引起的急性呼吸道傳染病。基於流行病學調查，潛伏期一般為3-7天，最長不超過14天。此次疫情臨床表現以發熱、乏力、乾咳為主要表現。少數患者伴有鼻塞、流涕、腹瀉等症狀。部分患者僅表現為低熱、輕微乏力等，無肺炎表現，多在1周后恢復。世界衛生組織將本次引起病毒性肺炎病例的病原體命名為2019新型冠狀病毒，即“2019-nCoV”。
新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬於β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140nm，是2019年前已知的可以感染人的第7種冠狀病毒，其餘6種冠狀病毒分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4種在人群中較為常見，致病性較低，一般僅引起類似普通感冒的輕微呼吸道症狀；另外2種是SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒（中東呼吸綜合症冠狀病毒）。
2019年前傳統的分離培養法培養檢測2019新型冠狀病毒耗時長、成本高，未能形成快速、完整的2019新型冠狀病毒檢測體系。
因此，針對新型冠狀病毒（2019-nCoV）有必要開發快速、靈敏、使用便捷的檢測體系，以滿足臨床需要。
發明內容
專利目的
《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》針對新型冠狀病毒基因組ORF1ab基因開發了新型冠狀病毒診斷體系，能夠高效率、高特異性、低成本的對新型冠狀病毒2019-nCoV感染患者進行檢測。
技術方案
在《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》的第一方面，提供了一種用於檢測新型冠狀病毒核酸的引物對集，所述引物對集包括：第一引物對組，所述第一引物對組包括：如SEQIDNO.1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.2所示的反向引物。在另一優選例中，所述引物對集還包括：內標引物對組，所述內標引物對組包括：如SEQIDNO.4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.5所示的反向引物。
該發明的第二方面，提供了一種多重檢測新型冠狀病毒核酸的探針組，所述探針組包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探針。
在另一優選例中，所述探針組還包括核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的內控探針。在另一優選例中，各探針的5’端包含有螢光報告基團；和/或，各探針的3’端包含有螢光淬滅基團。在另一優選例中，各探針標記的螢光報告基團互不相同。
該發明的第三方面，提供了一種用於多重檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，所述試劑盒包括該發明第一方面所述的引物對集。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括該發明第二方面所述的探針組。在另一優選例中，所述試劑盒包括第一容器，所述第一容器內包含引物探針混合液，所述引物探針混合液中包含SEQIDNO.1-6所示的多核苷酸序列；優選地所述引物探針混合液由PCR緩衝液配製。在另一優選例中，所述第一容器內還包含dNTPs。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括第二容器，所述第二容器內包含PCR酶系，所述PCR酶系包括熱啟動酶、和逆轉錄酶；優選地，所述第二容器內還包括RNA酶抑制劑。在另一優選例中，所述試劑盒還包括第三容器，所述第三容器內包含陽性對照品，所述陽性對照品包含具有ORF1ab基因片段的假病毒；優選地，所述第三容器內還包含具有內標核酸片段的假病毒。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括第四容器，所述第四容器內包含陰性對照品；優選地，所述陰性對照品為生理鹽水。在另一優選例中，所述試劑盒還包括第五容器，所述第五容器內包含內標；優選地，所述內標為含內標核酸片段的假病毒。
該發明的第四方面，提供了一種多重檢測新型冠狀病毒核酸的方法，所述方法包括步驟：
（1）提供待檢測對象的核酸樣本；
（2）製備PCR反應體系並進行PCR檢測：其中，所述PCR反應體系包括：步驟（1）提供的所述核酸樣本、該發明第一方面所述的引物對集、和該發明第二方面所述的探針組。
在另一優選例中，所述核酸樣本可來自咽拭子樣本、肺泡灌洗液樣本、血液樣本、痰液樣本、糞便樣本或環境樣本。在另一優選例中，所述方法為非診斷目的的檢測方法。在另一優選例中，所述PCR反應體系還包括陽性對照品，和/或陰性對照品。在另一優選例中，所述PCR反應體系還包括PCR酶系。
該發明的第五方面，提供了該發明第一方面所述的引物對集、和/或該發明第二方面所述的探針組的用途，用於製備PCR檢測試劑盒，所述PCR檢測試劑盒用於檢測新型冠狀病毒2019-nCoV核酸。
有益效果
該發明的有益效果在於：該發明通過針對性檢測新型冠狀病毒2019-nCoV的ORF1ab基因核酸靶標，能夠高效率、高特異性、高靈敏度、低成本的對新型冠狀病毒2019-nCoV感染患者進行檢測，顯著提高了病毒鑑定的準確性。該發明適用於對新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的檢測，為病毒鑑定和防控提供可靠的依據，值得推廣套用。另外，該發明的方法同樣適用於非診斷的目的，例如，在疫情防控過程中，使用該發明的檢測方法對環境中的病毒核酸進行檢測，這些病毒核酸信息可以作為公眾健康管理之需。
附圖說明
圖1：顯示了不同濃度梯度FAM通道檢測結果；
圖2：FAM通道重複性檢測結果；
圖3：VIC通道重複性檢測結果；
圖4：典型臨床樣本檢測結果；
圖5：對照引物組對ORF1ab-F2、ORF1ab-R2和ORF1ab-P2檢測結果；
圖6：對照引物組對ORF1ab-F3、ORF1ab-R3和ORF1ab-P3單重檢測結果；
圖7：對照引物組對ORF1ab-F3、ORF1ab-R3和ORF1ab-P3雙重檢測結果；
權利要求
1.一種用於檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括引物對集和探針組；其中，所述引物對集包括第一引物對和內標引物對，所述第一引物對包括：如SEQIDNO.1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.2所示的反向引物，所述內標引物對包括：如SEQIDNO.4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.5所示的反向引物；所述探針組包括：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探針，和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的內控探針。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括第一容器，所述第一容器內包含引物探針混合液，所述引物探針混合液中包含所述引物對集和所述探針組。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括第二容器，所述第二容器內包含PCR酶系，所述PCR酶系包括熱啟動Taq酶和逆轉錄酶。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述第二容器內還包含RNA酶抑制劑。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括第三容器，所述第三容器內包含陽性對照品，所述陽性對照品包含具有ORF1ab基因片段的假病毒。
6.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括第四容器，所述第四容器內包含陰性對照品。
7.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括第五容器，所述第五容器內包含內標；所述內標為含內標核酸片段的假病毒。
8.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述第一容器內還包括dNTPs。
9.一種非診斷目的的多重檢測新型冠狀病毒核酸的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟：
（1）提供待檢測對象的核酸樣本；
（2）製備PCR反應體系並進行PCR檢測：其中，所述PCR反應體系包括：步驟（1）提供的所述核酸樣本、引物對集和探針組；所述引物對集包括第一引物對和內標引物對，所述第一引物對包括：如SEQIDNO.1所示的正向引物和如SEQIDNO.2所示的反向引物，所述內標引物對包括：如SEQIDNO.4所示的正向引物和如SEQIDNO.5所示的反向引物；所述探針組包括：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探針和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的內控探針。
10.權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述核酸樣本來自環境樣本。
實施方式
操作內容
該專利發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種檢測新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的試劑盒及方法，採用ORF1ab基因特異引物和Taqman探針，結合特異的內標引物、探針體系監控樣本提取、檢測過程，實現對新冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因的檢測，具有特異性強、靈敏度高、準確性高、快速簡便等多種優點，可用於科研和臨床套用檢測，包括對新型冠狀病毒的流程病學研究等方面。
在描述該發明之前，應當理解該發明不限於所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應當理解該文所用的術語其目的僅在於描述具體實施方案，並且不意圖是限制性的，該發明的範圍將僅由所附的權利要求書限制。
除非另外定義，否則該文中所用的全部技術與科學術語均具有如該發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如該文所用，在提到具體列舉的數值中使用時，術語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多於1％。例如，如該文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值（例如，99.1、99.2、99.3、99.4等）。
雖然在該發明的實施或測試中可以使用與該發明中所述相似或等價的任何方法和材料，該文在此處例舉優選的方法和材料。
多重PCR（multiplexPCR），又稱多重引物PCR或複合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。
影響多重PCR反應的因素有很多，比如：
（1）反應體系不平衡，反應體系的不平衡導致在前期的幾輪反應中某些優勢引物及其模板迅速擴增，獲得大量的擴增產物，而這些擴增產物同時又是DNA聚合酶的良好抑制劑。所以，隨著擴增產物的大量出現，聚合酶的聚合能力被越來越強烈的抑制，因此，前期處於劣勢的引物及其模板，這時就更加難以反應，最終導致擴增產物量非常之小，以至於無法檢測。
（2）引物特異性，如果引物與體系中其他非目的基因片段結合力更強，那么目的基因結合引物的能力就會受到竟爭，從而導致擴增效率下降。
（3）最佳退火溫度不一致，將多對引物放置入一個體系中擴增，由於進行PCR反應的退火溫度相同，所以要求每一對引物的最佳退火溫度接近。
（4）引物二聚體，包括引物間的二聚體以及引物自身所形成的發卡結構，還有一類是第三方DNA介導的聚體，這些二聚體和非特異引物一樣都會干擾引物與目標結合位點的竟爭，影響擴增效率。
雖然上述提及了影響擴增效率的幾個因素，但更多的因素尚不清楚。到2019年前為止，還沒有一個可以明確預測擴增效率的有效方法。
該發明提供的檢測新型冠狀病毒的ORF1ab基因的檢測試劑盒，該試劑盒同時包括內源性內標檢測系統，用於對標本採集、核酸提取過程及PCR擴增過程的監控，可減少假陰性結果的出現。該試劑盒為雙重螢光檢測試劑盒，具有敏度高、特異性強、重複性好等特點。
該發明提供一種特異性檢測樣品中ORF1ab基因的引物序列為：SEQIDNO.1：TTAAGCGGACACAATCTTGCT和SEQIDNO.2:GTTGAATGTCTTCACCTTTGTTAA，對應的檢測探針的序列為SEQIDNO.3:CACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAA。
在一個實施例中，所述試劑盒還包括內標質控及擴增引物和檢測探針；內標質控擴增引物序列分別為：SEQIDNO.4:TCTGTATTGTTTCCTTCATCGTATT和SEQIDNO.5:ATGATGCACCTTTCAGAACGTA，對應的檢測探針的序列為SEQIDNO.6：TGTGCACTTACTGCCTCACTTAACGACAGG。
內標既可監測樣本採集，也可監測樣本提取過程，防止樣本核酸提取失敗導致假陰性。
在該發明的一個優選地實施方式中，內標片段的核酸序列如下：TCTGTATTGTTTCCTTCATCGTATTTACAACAGACAGATACTGTGCACTTACTGCCTCACTTAACGACAGGGATACGTTCTGAAAGGTGCATCAT（SEQIDNO.:7）
在其中一個實施例中，所述試劑盒包括含ORF1ab基因片段的陽性對照，以及陰性對照（滅菌生理鹽水）。
在該發明的一個優選地實施方式中，陽性對照中ORF1ab基因片段的核酸序列如下：TTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAAC（SEQIDNO.:8）。
在其中一個實施例中，所述試劑盒包括：PCR反應液，包括：ORF1ab基因和內標基因的引物、探針，dNTPs（dATP:dCTP:dGTP:dTTP=1:1:1:1）及PCR緩衝液；PCR酶系，包括：熱啟動Hot.Taq酶和c-MMLV酶。
優選地，引物和探針的濃度為0.1-1微米，dNTPs濃度為0.2-0.4mM，MgCl2濃度為2-5mM，c-MMLV酶為1-3U，熱啟動Hot.taq為2.5-10U。
因此，該發明的一個優選的實施方式中，該發明提供了一種用於檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，所述試劑盒包括引物對集和探針組；其中，所述引物對集包括第一引物對和內標引物對，所述第一引物對包括：如SEQIDNO.1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.2所示的反向引物，所述內標引物對包括：如SEQIDNO.4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.5所示的反向引物；所述探針組包括：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探針，和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的內控探針。
該發明還提供了一種ORF1ab基因檢試劑盒的使用方法，包括如下步驟：提取待測樣本（提取試劑採用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取或純化試劑（貨號：DA0623），得到核酸樣本（陽性質控和陰性質控同步參與提取）；取5微升加入到上述PCR反應液（17微升）和酶系混合物（3微升）中，在實時螢光PCR儀中進行擴增反應，螢光通道依次選擇VIC、FAM、和Cy5，PCR擴增程式如下；50℃，15分鐘，95℃，15分鐘；1個循環；94℃，15sec，55℃，45sec（蒐集螢光）；45個循環。
PCR結束後通過不同螢光通道曲線及Ct值判斷新型冠狀病毒核酸陰、陽性，檢測結果可用於新型冠狀病毒感染的輔助診斷以及藥物療效的觀察，為研究提供可靠的依據。
該發明中新型冠狀病毒2019-nCoV的基因序列參見GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019|EPI_ISL_406798；關於其ORF1ab基因的寡核苷酸序列信息可參考文獻（RoujianLu，XiangZhao，JuanLi，et.al，Genomiccharacterisationandepidemiologyof2019novelcoronavirus:implicationsforvirusoriginsandreceptorbinding.Lancet.2020Jan30）。
該試劑盒組成詳見表1和表2，可檢測新型冠狀病毒2019-nCoV的ORF1ab靶標基因。
表1試劑盒組成 | |
組成 | 主要組分 |
PCR反應液 | 特異性引物和螢光探針（SEQ ID NO .:1-6）、dNTPs、PCR緩衝液 |
PCR酶系 | 熱啟動Hot.Taq酶、逆轉錄酶C-MMLV、RNA酶抑制劑 |
陽性對照品 | 含ORF1ab基因片段假病毒 |
陰性對照品 | 生理鹽水 |
內標 | 含內標片段的假病毒 |
試劑盒所需引物、探針序列如表2：
表2引物、探針及序列號 | ||
引物探針名稱 | 引物/探針序列 | SEQ ID NO. |
ORF1abF | TTAAGCGGACACAATCTTGCT | 1 |
ORF1abR | GTTGAATGTCTTCACCTTTGTTAA | 2 |
ORF1ab Probe | FAM-CACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAA-BHQ1 | 3 |
內標ICF | TGAGGGAGTGCAACGTTATT | 4 |
內標ICR | ATCGGTTTTGGCTGCATA | 5 |
內標IC Probe | VIC-TCGCTCAAGGGAGAAAGGTCC-BHQ1 | 6 |
優選地，所述螢光基團選自下組：FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5。優選地，所述淬滅基因選自下組：MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。
該發明的引物設計中，對特異性引物及探針經大量試驗篩選，並對其進行組合、最佳化、驗證，最終優選出組合後不會互相干擾、擴增效率高、特異性好的多重檢測最優引探組合。
該發明所述試劑盒用於判定檢測有效標準為：每次檢測均同時檢測陰性質控品、陽性質控品，當檢測結果的陽性質控品為陽性，且陰性質控品為陰性時，表明實驗結果有效。
該發明所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：
（1）提取檢測樣本中的總核酸，獲得核酸樣本。
（2）將所述核酸樣本與PCR反應液、PCR酶系混合，製得PCR反應體系。
（3）實時螢光PCR反應，程式如下：第一階段：50℃2-15分鐘，95℃10-15分鐘，1個循環；第二階段：94℃10-15秒，55-60℃45秒，45個循環。PCR結束後通過不同螢光通道曲線及Ct值判斷對應病原體核酸的陰、陽性給出檢測結果。
實施案例
下面結合具體實施例，進一步詳陳該發明。應理解，這些實施例僅用於說明該發明而不用於限制該發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如美國Sambrook.J等著《分子克隆實驗室指南》（黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。
實施例1
新型冠狀病毒ORF1ab基因檢測試劑盒：該試劑盒由PCR反應液、PCR酶系、內標、陽性對照品、陰性對照品和DEPC水構成，其中PCR反應液由5×RT-PCRBuffer、引物和探針、dNTPs組成；PCR酶系由逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、熱啟動DNA聚合酶和酶稀釋液構成；陽性對照品由含ORF1ab靶標序列的假病毒製備而成，陰性對照品為生理鹽水，內標為含內標靶序列的假病毒製備而成。
所述引物在擴增體系中的終濃度為800nM，探針終濃度為200nM。
該試劑盒的反應體系為25微升，具體如下：PCR酶系3微升，PCR反應液17微升，核酸模板2-5微升，補DEPC水至25微升。
實施例2
試劑盒的操作和結果判定
（1）病毒基因組DNA的提取
採用中山大學達安基因股份有限公司的核酸提取或純化試劑（貨號：DA0623）在樣本處理區按照說明書操作步驟提取核酸。提取前每例樣本按50：1的比例加入內標進行提取。陰性對照品和陽性對照品均參與提取，作為對環境和PCR檢測試劑的質控。
（2）反應體系的配製
採用實施例1的試劑盒進行以下實驗，待試劑盒PCR反應液在室溫條件下完全溶解後，快速震盪混勻，25微升PCR反應體系為：PCR反應液17微升，酶系3微升，模板5微升。
（3）PCR擴增
將PCR管放入螢光PCR儀（ABI7500）中，按照如下要求設定PCR反應程式：
程式1，50℃、15分鐘、1次循環；
程式2，95℃、15分鐘、1次循環；
程式3，94℃、15秒，55℃、45秒（收集螢光），45次循環。
（4）質量控制
該試劑盒的結果判讀如下；
陰性對照品：FAM檢測通道無擴增曲線；VIC檢測通道有擴增曲線；
陽性對照品：FAM檢測通道有擴增曲線，且Ct值≤35；VIC檢測通道有或無擴增曲線；
以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
（5）結果判讀
（5.1）若檢測樣品的FAM檢測通道無擴增曲線，且該VIC通道有擴增曲線，可判樣品為未檢測到新型冠狀病毒RNA；
（5.2）若檢測樣品的FAM檢測通道有擴增曲線且Ct值≤40，VIC檢測通道有或無擴增曲線，可判樣品為新型冠狀病毒陽性。
實施例3
試劑盒特異性檢測：採用實施例1所述的試劑盒對甲型流感H3N2，H7N9，乙型流感Yamagata，呼吸道合胞病毒A型，腺病毒1、3型，腸道病毒A型，人偏肺病毒，EB病毒，人巨細胞病毒，輪狀病毒，諾如病毒，肺炎支原體，結核分枝桿菌，冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63，229E），SARS假病毒，MERS假病毒）和新型冠狀病毒（2019-nCoV）進行檢測，均無FAM通道螢光的檢出；而對新型冠狀病毒陽性樣本檢出為陽性。表明該發明試劑盒特異性好。
實施例4
試劑盒靈敏度檢測：將製備的含新型冠狀病毒ORF1ab基因靶標序列的假病毒梯度稀釋至10copies/ml、10copies/ml、10copies/ml、10copies/ml、10copies/ml、5×10copies/ml、10copies/ml、使用實施例1所述的試劑盒對上述稀釋後的模板分別進行擴增，根據實施例2中的結果判定標準進行判定，該發明試劑盒對新型冠狀病毒檢測靈敏度結果如表2所示：
表2新型冠狀病毒檢測靈敏度結果 | |||||||
10copies/ml | 10copies/ml | 10copies/ml | 10copies/ml | 10copies/ml | 5×10copies/m | 10copies/ml | |
重複1 | + | + | + | + | + | + | - |
重複2 | + | + | + | + | + | + | - |
+：新型冠狀病毒陽性；-：未檢出新型冠狀病毒RNA。圖1顯示了不同濃度梯度FAM通道檢測結果。
從表2和圖1可見，在濃度低至5×10copies/ml時，實施例1所述試劑盒仍能檢出。因此，在低濃度模板時，該發明所述試劑仍能檢出，因而具有很高的靈敏度。
實施例5
試劑盒重複性檢測：將製備的含新型冠狀病毒ORF1ab靶標序列的假病毒稀釋至5×10copies/ml、5×10copies/m濃度，使用實施例1所述的試劑盒對上述稀釋後的假病毒分別進行擴增，每個濃度梯度重複檢測10次。根據實施例2中的結果判定標準進行判定，該發明試劑盒對新型冠狀病毒檢測重複性結果如圖2、圖3所示。從圖2和圖3可見，在中、低濃度時，實施例1所述試劑盒檢測重複性好。
實施例6
臨床樣本檢測：檢測樣本核酸的提取：
（1）臨床待測樣本核酸模板提取
採集22例疑似咽拭子臨床樣本，提取待測樣本（提取試劑採用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取或純化試劑（貨號：DA0623），得到核酸樣本（陽性質控和陰性質控同步參與提取）；取5微升核酸樣本配製PCR反應體系，在實時螢光PCR儀中進行擴增反應，螢光通道依次選擇VIC、FAM，PCR擴增程式如下；50℃，15分鐘，95℃，15分鐘；1個循環；94℃，15sec，55℃，45sec（收集螢光）；45個循環。
PCR結束後通過不同螢光通道曲線及Ct值判斷對應病原體核酸的陰、陽性。在所檢測的22例疑似臨床樣本中，共檢出6例新型冠狀病毒2019-nCoV核酸陽性臨床樣本。典型檢測結果如圖4所示。
測序驗證結果表明該發明檢測體系檢測準確率達到了100%，進一步證明了該發明體系檢測的臨床檢測準確性。
對比例1
該發明人在研究過程中，針對新型冠狀病毒2019-nCoV目標核酸序列篩選了數十組PCR引物和探針，經過大量測試，最終獲得了靈敏度和特異性能夠滿足臨床檢測需求，且能夠進行多重檢測的引物、探針組合。
針對新型冠狀病毒2019-nCoV的ORF1ab基因檢測靶標，該發明人經過了大量的篩選、組合。設計的部分典型引物序列如下：
對照上游引物ORF1ab-F2：CTGCTCGTGTTGTACGATCAA（SEQIDNO.9）
對照下游引物ORF1ab-R2：TTGTTATAGCGGCCTTCTGTAA（SEQIDNO.10）
對照探針ORF1ab-P2：TTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCA（SEQIDNO.11）
對照上游引物ORF1ab-F3：AATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTG（SEQIDNO.12）
對照下游引物ORF1ab-R3：GCACAGAATTTTGAGCAGTTTC（SEQIDNO.13）
對照探針ORF1ab-P3：TGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCC（SEQIDNO.14）
具體檢測步驟、檢測條件、探針序列同以上實施例，進行PCR檢測測試。
使用ORF1ab-F2和ORF1ab-R2的檢測5例新型冠狀病毒（2019-nCoV）陽性樣本，只有4例檢出陽性。結果如圖5所示，檢測結果表明該引物對準確性較差。
使用ORF1ab-F3和ORF1ab-R3的檢測結果表明該引物對在單一檢測體系中對ORF1ab基因靶核酸的特異性和靈敏度較佳，但是在多重檢測體系中ORF1ab基因靶低濃度核酸擴增受到明顯抑制，單重和多重體系檢測結果如圖6和圖7所示。表明對照引物對ORF1ab-F3和ORF1ab-R3無法套用於多重檢測體系中。
榮譽表彰
2021年11月，《新型冠狀病毒ORF1ab基因核酸檢測試劑盒》獲得第八屆廣東專利獎金獎。
