基本介紹
定義,原理,關鍵技術,作用,用例,
定義
suspension culture
非貼壁依賴性細胞的一種培養方式。
原理
利用固體瓊脂培養基對植物的離體組織進行培養的方法在植物遺傳實驗中已經得到廣泛的套用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養成分、植物組織產生的代謝物質呈現一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養物產生影響，從而導致植物組織生長發育過程中代謝的改變而利用液體培養基則可以克服這一缺點，當植物的組織在液體培養基中生長時，我們可以通過薄層震盪培養或向培養基中通氣用以改善培養基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。
關鍵技術
生物製品生產過程研發的兩個主要目的是提高產率、保證產物的質量和過程工藝設計的一致性、前者直接關係到商業化生產的可行性，後者則關係到藥物的安傘和有效性。對應懸浮培養技術主要包括高表達細胞株的獲得、個性化培養基的研發、動物細胞反應器及配套設施的完善及生產工藝的最佳化等四個方面。
細胞與毒株的馴化與保藏
為提高生物製品的產率和安傘有效性，在生物反應器中繁殖的病毒與細胞需要進行相互適應選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對於細胞大規模生產具有重要意義。
細胞的篩選馴化和保藏
實現懸浮培養首先需要選擇合適的宿主細胞，細胞系的特徵直接影響放大的可能性以及放大技術的選擇。同一種細胞在懸浮培養和貼罐培養時對同一病毒的敏感性不同；同一株細胞不同的克隆對營養條件有不同的需求，對病毒敏感性亦可能不同。 常根據毒株特性，綜合考慮所用毒株能在何種細胞上增殖、表達，懸浮或貼壁細胞屬性足否適合大規模培養，規模和技術是否影響表達的穩定性，能否進行馴化，馴化後毒株的敏感性和表達量是否有變化等因素選擇合適的宿主細胞。
細胞篩選馴化的實質是套用現代細胞生物學技術，在降低細胞凋亡率、提高細胞活力、延長細胞生命周期、提高產物濃度等方面進行研究，結合特定細胞的營養需求進行培養基最佳化，篩選適用於生產的細胞株。
為實現馴化的穩定，通常由高密度細胞培養轉向低密度細胞培養，由高濃度血清培養逐漸降低血清濃度進行培養。因細胞損傷後難以修復，所以馴化時細胞活力應保持在90%以上。細胞的增殖能力直接影響產能，馴化時應保持對其增殖能力的測定。細胞馴化時還應對其表達分泌能力進行測定，避免馴化後的細胞表達特性發生變化。馴化後細胞的增殖能力、活力及生產能力要能夠滿足工業大規模生產的需要。由於特定細胞的營養需求不同，實現其馴化的難易程度也不同，在馴化時需要選用合適的細胞培養基，有針對性地補充某些營養成分以滿足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無血清生長的特性。與20世紀80年代相比，由於細胞培養基技術的發展，細胞馴化變得相對容易。
在篩選馴化過程中應注意及時對細胞進行保藏，以避免在培養過程中出現異常情況導致篩選馴化工作量的重複和時間浪費。保藏時，應選用在該馴化條件下細胞狀態良好的細胞。
病毒對細胞的敏感性關係
培養動物細胞的目的是通過細胞製備足夠量的病毒，因此，毒株對細胞的敏感性非常重要。但在實際套用中，毒株對細胞的敏感性、差異性較大。不同細胞對同一病毒敏感性不同，同一細胞對不同病毒株敏感性不同；懸浮細胞和貼壁細胞的敏感性不同；同一病毒株可在多種宿主細胞上生長，一種細胞系平台也可能生產多種病毒；同一細胞不同培養方式的病毒量、抗原結構、免疫原性、毒力等也可能不同。
當病毒對一些細胞基質不夠敏感時，可以通過傳代馴化的方式，使病毒逐步適應該細胞基質，最終滿足生產疫苗的需求。在最佳化培養工藝的基礎上，作為種源的毒株及相應細胞株的篩選最佳化，提高細胞培養的質量和病毒表達量已是當前提高產率的一個技術要點，也是降低成本、提高生產競爭力的關鍵之一。
細胞培養基的個性化和最佳化
在大規模培養技術中，維持細胞高密度甚至無血清生長，細胞培養基的營養含量對細胞的增殖、維持至關重要。在懸浮培養技術中，不同細胞營養代謝的特異性不同，細胞和病毒培養工藝不同，需要抗剪下力、滿足放大功能，還需要提高目標生物製品的穩定性、表達量，這些均需要個性化培養基的支持。
細胞培養基經過天然培養基、合成培養基，發展到無血清培養基、無蛋白培養基、限定化學成分培養基，近百年的發展，已發生質的飛躍。無血清培養基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產品易於純化、回收率高；其成分明確，有利於研究細胞的生理調節機制；還可根據不同細胞株設計和最佳化適合其高密度生長或高水平表達的培養基。從對人類和動物安全性的長遠考慮，生物製品生產越來越傾向採用無血清無動物組分培養基，國際上生物製藥生產中，已經有50%以上採用無血清細胞培養基。
細胞培養工藝的研發
懸浮培養過程技術的開發和套用主要是生產工藝的開發和工藝過程最佳化，維持細胞生長和病毒繁殖的最最佳化環境控制，在懸浮培養技術中的作用同樣至關重要。
懸浮培養和微栽體培養工藝
懸浮培養技術按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養工藝和貼壁細胞微載體懸浮培養工藝。懸浮細胞(CHO細胞、BHK21l細胞等)可以在反應器中直接生產增殖，細胞自由生長、培養環境均一、取樣簡單、培養操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低；而貼罐細胞在反應器中懸浮培養需要藉助微載體，細胞和球體接觸部位營養環境較差，培養、取樣觀察及放大工藝複雜，成本高。雖然相對於懸浮培養，微載體培養工藝複雜，但與轉瓶培養相比仍有很大優勢．能提高生產規模、產品質量和勞動效率，因此是貼壁細胞懸浮培養的主要手段。
懸浮培養工藝及選擇
細胞懸浮培養工藝按照培養方式分為批培養、流加培養及灌注培養。批培養能直觀反映細胞在生物反應器中的生長、代謝變化，操作簡單，但初期代謝廢產物較多，抑制細胞生長，細胞生長密度不高；流加培養操作簡單、產率高、容易放大，套用廣泛，但需要進行流加培養基的設計；灌注培養的培養體積小，回收體積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，利於保持產品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養基利用效率低、旋轉過濾器容易堵塞等。不同的病毒採用的培養方式不同，如對於分泌型且產品活性降低較快的生物製品，宜採用灌注培養，且灌注培養也更適宜於微載體培養。同一生物製品由於其營養環境的不同，其生產工藝也可能發生變化，如BHK21細胞生產口蹄疫病毒，低血清培養時採用批培養，接毒前需要更換無血清的維持液；而無血清培養過程中無需換液，配合流加培養可能效果更好。選擇反應器懸浮培養工藝需要考慮細胞和病毒的關係、產物穩定性、細胞培養基或添加物的選擇、細胞培養規模等幾個因素。
懸浮培養過程參數控制 選定合適的生產工藝後，過程控制成為關鍵。為確保細胞牛長在最優環境中，需要利用反應器的線上監控功能控制各種運行參數。細胞對溫度較敏感，需要採用合適的加熱或冷卻方式控制培養溫度在35℃～37℃，避免細胞受到損傷。動物細胞生長適宜的pH範圍一般在6.8～7.3之間，低於6.8或高於7.3都可能會對細胞生長產生不利的影響。
生物反應器的選擇
反應器規模能否放大是選擇反應器的一個霞要前提，懸浮培養規模的放大主要通過增加反應器體積或者增加反應器數量，增大反應器體積可以節省大量的配套工程及人員成本，而多台小的反應器雖然操作靈活，但成本相對高。在國外生物製品生產中採用的多是較大規模的、能夠逐級放大的生物反應器。選擇和配置生物反應器還需考慮和滿足生產工藝和產能需求。反應器接口的標準化、配件提供速度及售後服務質量等，均應作為工業化選用生物反應器考慮的因素，以免造成生產的延誤。
作用
一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養。在培養過程中不斷進行旋轉震盪，一般可用100～120 r/min 的速度進行。由於液體培養基的旋轉和震盪，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養基中的培養物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死細胞殘渣。
