基本介紹
- 中文名：原生質體共培養法
- 外文名：Protoplast co-culture method
- 原生質體：除去細胞壁後裸露的球形細胞團
- 套用：遺傳轉化、突變體篩選等
- 屬於：體細胞雜交
- 方法：固體、液體和固液培養法等
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植物原生質體
植物原生質體（protoplast）是指除去了細胞壁後裸露的球形細胞團。由於沒有細胞壁這個細胞與外部環境之間的天然屏障，使得原生質體成為理想的實驗系統而被廣泛套用於基礎理論研究、遺傳轉化、無性系變異及突變體篩選、細胞器的分離及導入、種質資源保存等領域。然而，原生質體最令人矚目的套用是體細胞雜交。原生質體培養是體細胞雜交的關鍵技術之一，對該技術的研究有利於體細胞雜交的進一步深入發展。
原生質體分離材料
原生質體可從許多植物的組織和器官中分離得到，分離材料包括葉片、葉柄、芽尖、根、果實、胚芽鞘、胚軸、莖、胚芽、花粉粒、愈傷組織和細胞懸浮培養物等。目前，植物原生質體的主要來源是植物的葉片、愈傷組織和懸浮培養細胞。葉片是常用的分離材料，這是因為葉肉細胞排列鬆散，酶液容易到達細胞壁，而且獲得的原生質體在生理和遺傳特性上也比較一致。外植體來源的愈傷組織和細胞懸浮培養物是植物原生質體研究中廣泛使用的分離材料。它的優點是：材料不受外界環境的影響，試驗的重複性好；原生質體的產量、活性及穩定性等較理想；可借鑑組織培養中的器官培養、花粉培養及細胞培養的經驗，對原生質體的分化潛力做出初步的估價。因此，葉片、愈傷組織、細胞懸浮培養物等作為原生質體游離的原始材料，各有特點，究竟選取哪種材料，不僅要參考前人的經驗，還要了解不同植物種類間存在的差異，視具體情況，區別對待。豆科牧草原生質體分離和培養研究中，葉片、愈傷組織和細胞懸浮培養物均是常見的起始材料。
原生質體分離方法
分離原生質體可採用兩種方法：機械分離法和酶解分離法。機械分離法是指將細胞放在高滲糖溶液中預處理，使之發生質壁分離，原生質體收縮成球形後，磨碎植物組織，從傷口處釋放出完整的原生質體。該法的不足之處是：原生質體產量低；枯燥費力；植物組織類型受到限制。如今，機械法分離原生質體已成為歷史，取而代之的是酶解分離法。酶解分離法是一種利用細胞壁降解酶，脫除植物細胞壁，從而獲得原生質體的方法。目前，原生質體分離中常用的酶有三大類：纖維素酶類、果膠酶類和半纖維素酶類。隨著各種商品酶製劑的研發，酶解法被廣泛套用於原生質體的分離，從而進一步推動了以原生質體為實驗材料的相關研究。該法的最大優點是：植物種類和部位不受限制；原生質體產量大。不足是酶製劑含有一些對植物細胞生長不利的物質，如酚類化合物等，在降解細胞壁的同時，會影響原生質體的活力。
原生質體共培養方法
分離出的原生質體經純化後，應立即進行培養。原生質體的共培養方法主要有固體培養法、液體培養法和固液培養法等，以及由此衍生出的一些其他方法。
固體培養法
固體培養法又稱瓊脂糖包埋法或平板培養法，是較早使用的原生質體培養方法。將熔化後冷卻至45℃的瓊脂與等體積的含原生質體懸浮液的培養基混合，凝固後成一薄層瓊脂平板。該法優點是原生質體均勻分布其中，位置固定，便於觀察單個原生質體的生長過程。該法缺點是：操作要求嚴格；混合時的溫度不宜掌握。因此，該法在常規培養中已較少採用。
液體培養法
液體培養法根據培養方式不同可分為液體淺層培養法、微滴培養法和懸滴培養法等。液體淺層培養法是將一定密度的原生質體懸浮培養於液體培養基中，形成薄層。該法操作簡單，通氣性好，對原生質體的損傷小，且易於添加新鮮培養基和轉移培養物。不足之處在於原生質體分布不均勻，難以定點觀察某一細胞的生長情況。
微滴培養法
微滴培養法是將原生質體懸浮液分散滴於培養皿底部，密封后培養。該法可進行較多組合的試驗，便於單個原生質體及融合體生長情況的觀察。缺點是原生質體分布不均，微滴易揮發。
懸滴培養法
懸滴培養法是將原生質體懸浮液分散接種到培養皿皿蓋上，密封后倒置培養。該法的優缺點與微滴法相似，易添加新鮮培養基，不易污染，均需特殊的培養皿，較微滴培養所需材料更少。
固液培養法
固液培養法即固液雙層培養法，先在培養皿底部鋪一層瓊脂糖固體培養基，再將原生質體懸浮液滴於固體培養基表面，其優點是固體培養基中的營養物質可緩慢釋放到液體培養基中，補充消耗，同時便於添加新鮮培養基，此外，培養基能保持濕度，原生質體分裂速度快。
培養方法對於原生質體的生長和分裂非常重要，不同的植物應採用不同的方法，同一種植物的原生質體採用不同的培養方法得到的結果也不同。原生質體究竟採用何種培養方法應根據材料的特點和研究的目的加以選擇，除培養方法外，原生質體的培養效果還受許多因素的影響，有不少種類原生質體沒有培養成功，培養成功的種類中也存在基因型的差異。
