植物細胞懸浮培養

植物細胞懸浮培養(Plant cell suspension culture) 指將游離的單細胞或細胞團按照一定的細胞密度懸浮在液體培養基中，用搖床或轉床進行培養的方法。

基本介紹

• 中文名：植物細胞懸浮培養
• 外文名：Plant cell suspension culture
• 培養：懸浮在液體培養基中
• 方法：搖床或轉床進行培養的方法
• 特徵：非貼壁依賴性細胞的一種培養方式
• 學科：植物學

簡介

植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。植物離體培養可產生愈傷組織。將疏鬆型的愈傷組織縣浮在液體培養基中並在振盪條件下培養一段時間後，可形成分散縣浮培養物。良好的縣浮培養物應具備以下特徵：（1）主要有單細胞和小細胞團組成；（2）細胞具有旺盛的生長和分裂能力，增殖速度快；（3）大多數細胞在形態上應具有分生細胞的特徵，它們多呈等徑形，核一質比率大，胞質濃厚，無液胞化程度較低。

基本原理

懸浮培養指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養基里，培養單細胞及小細胞團的組織培養系統，是非貼壁依賴性細胞的一種培養方式。某些貼壁依賴性細胞經過適應和選擇也可用此方法培養。增加懸浮培養規模相對比較簡單，只要增加體積就可以了。深度超過5mm，需要攪動培養基，超過10cm，還需要深層通入CO₂和空氣，以保證足夠的氣體交換。通過振盪或轉動裝置使細胞始終處於分散懸浮於培養液內的培養方法。

利用固體瓊脂培養基對植物的離體組織進行培養的方法在植物遺傳實驗中已經得到廣泛的套用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養成分、植物組織產生的代謝物質呈現一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養物產生影響，從而導致植物組織生長發育過程中代謝的改變而利用液體培養基則可以克服這一缺點，當植物的組織在液體培養基中生長時，我們可以通過薄層震盪培養或向培養基中通氣用以改善培養基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。

注意事項

在液體懸浮培養過程中應注意及時進行細胞繼代培養，因為當培養物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。對於多數懸浮培養物來說，細胞在培養到第18～25d 時達到最大的密度，此時應進行第一次繼代培養。在繼代培養時，應將較大的細胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養體系，就包括愈傷組織的誘導、繼代培養、單細胞分離和懸浮培養。目前這項技術已經廣泛套用於細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。

實驗步驟

1、用鑷子夾取出生長旺盛的鬆軟愈傷組織，放入三角瓶中並輕輕夾碎。每100ml三角瓶含滅過菌的培養基 10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織，以保證最初培養物中有足夠量的細胞。

2、 將已接種的三角置於旋轉式搖床上。在100r/min，25~28℃條件下，進行振盪培養。

3、經6~10天培養後，若細胞明顯增殖，可向培養瓶中加新鮮培養基10ml，必要時，可用大口移液管將培養物分裝成兩瓶，繼續培養。（若細胞無明顯增殖，可能是起始材料不適當，應考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）。可進行第一次繼代培養。

4、 懸浮培養物的過濾：按“3”法繼代培養幾代後，培養液中應主要由單細胞和小細胞團（不多於20個細胞）組成。若仍含有效大的細胞團，可用適當孔徑的金屬網篩過濾，再將過濾後的縣浮細胞繼續培養。

5、細胞計算。取一定體積的細胞縣液，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置70℃水浴處理15min。冷卻後，用移液管重複吹打細胞懸液，以使細胞充分分散，混勻後，取一滴縣液置入血細胞計數板上計數。

6、 製作細胞生長曲線：為了解縣浮培養細胞的生長動態，可用以下方法繪製生長曲線圖：
1) 鮮重法（fresh weigh method）在轉代培養的不同時間，取一定體積的懸浮培養物，離心收集後，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養時間為橫座標，繪製鮮重增長曲線。
2) 乾重法（dry weigh method ）可在稱量鮮重之後，將細胞進行曲烘乾，再稱量乾重。以乾重為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪製細胞乾重生長曲線。
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次，共取7次，每個樣品重複三次，整個實驗進行期間不再往培養瓶中換入新鮮培養液。

7、 細胞活力的檢查。對於初學者，往往需要檢測活細胞的比率。可在培養的不同階段，吸取一滴細胞縣液，放在載玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花紅溶液（用培養基配製）染色，在顯微鏡下觀察。幾活細胞均不著色，而死細胞則很快被染成紅色。也可用0。1%螢光雙醋酸酯溶液染色，凡活細胞將在紫外光誘發下顯示藍絕色螢光，有經驗的操作者，則可根據細胞形態，胞質環流判別細胞的死活。

8、細胞再生能力的鑑定：為了解懸浮培養細胞是否仍具有再生能力，可將培養細胞轉移到瓊脂固化的培養基上，使基再形成愈傷組織，進而在分化培養基上，誘導植株的分化。