基本介紹
- 中文名：細胞固定化培養技術
- 外文名：Cell immobilization technique
- 方法：包埋在網狀支持物進行無菌培養
- 優點：反覆使用，提高細胞活力等
定義,特點,優點,缺點,固定方法,常用細胞反應器,注意事項,
定義
細胞固定化培養技術是將植物懸浮細胞包埋在多糖或多聚化合物(如聚丙烯)網狀支持物中進行無菌培養的技術。由於細胞處於靜止狀態，促使細胞以多細胞狀態或局部組織狀態一起生長，所建立的物理和化學因子就能對細胞提供一種最接近細胞體內環境的環境。固定化是植物細胞培養方法中一種最為接近自然狀態的培養方法。
經過植物組織培養研究者的努力，已有多種植物細胞培養物已進人中試階段和實現了工業化生產。當然植物細胞培養也存在一些問題，例如，培養中的細胞遺傳和生理的高度不穩定性，目標物的產量低，放大培養困難，植物細胞的生長速度慢等，使得作為商業目的的植物細胞培養成本過高，為此尋找一條把植物細胞固定化作為次生代謝物生產的生物催化劑的新途徑是很有必要的。與液體懸浮培養相比，固定化培養具有較多優點：①固相細胞接觸緊密，生長緩慢，細胞擬組織化，從而有利於次生物的積累。②細胞包埋在聚合物中得到保護，可以減少剪下力的損傷作用。③固相培養更有利連續培養及生物轉化過程的實現。④高密度的細胞群體，可建立細胞間的物理、化學聯繫，細胞位置的相對固定，有利於物化梯度的建立，更有利於產物的合成。⑤環境條件易於控制，次生代謝物易於釋放。
特點
(1)固定化培養的細胞生長緩慢
當細胞被固定在一種惰性基質上面或裡面時，與在懸浮液培養基中的細胞相比，細胞以較慢的速度生長並產生較多的次生代謝產物。有證據表明，細胞生長速度和次生代謝物積累之間存在著負相關性，因此，固定化細胞的緩慢生長有利於次生代謝物的高產。
(2)細胞的組織化水平高
人工聚集(固定化)不僅使培養細胞的生長速度減慢，而且細胞與細胞之間的緊密接觸提高了細胞的組織化水平，使其越接近於整體植株的水平，從而使培養細胞以與整體植株相同的方式對環境因子的刺激起反應，這更有利於次生代謝物的產生和積累。如Lindsey發現，在生物鹼的積累能力上，聚集的或部分組織化的細胞要比生長迅速而鬆散的細胞高。
(3)易於次生代謝物的收集
目前植物細胞固定化培養體系大多是一個連續的生產體系，很容易使所要的代謝物從細胞運送到周圍的介質里，並能很容易地將此化合物從營養介質里分離出來，而且固定化細胞培養體系使得在收集產物時對細胞不產生傷害。此外，在固定細胞上用化學處理來誘導產物的釋放是相當容易進行的，這可以套用到在那些天然情況下不向外釋放產物的細胞上。這一點對把次生代謝物的產量提高到最大限度是很重要的，因為它消除了反饋抑制作用。
優點
經過多年的研究發現，與懸浮培養相比，固定化培養具有很多優點：①提高了次生物質的合成、積累；②能長時間保持細胞活力；③可以反覆使用；④抗剪下能力強；⑤耐受有毒前體的濃度高；⑥遺傳性狀較穩定；⑦後處理難度小等特點。目前又發現了固定化培養的新優點：①一般情況下，由於在固定化細胞團中形成了光密度梯度，內部的細胞有了較好的生長，所以固定化有助於植物細胞的光合作用。Kurata等用海藻鈣凝膠固定阿拉伯咖啡細胞，發現生物鹼產量與光密度的變化一致，而且細胞的生長不被高的光密度抑制。②在固定化培養中，產物和對細胞生長有抑制作用的代謝物可被培養基帶走；這樣，一方面有利於產物的生成，另一方面也防止了已生成產物的進一步降解轉化。實驗證明菸草細胞的固定化促進了其產物酚醛塑膠(phenolics)的釋放。同時還發現包埋的菸草細胞和Solarium aviculare，能夠將在懸浮培養時不釋放的異東莨菪苷(scopolin)釋放到培養基中。
缺點
當然，固定化細胞也存在一些缺點，主要表現為：①必須保持菌體的完整，防止菌體的自溶，否則會影響產物的純度；②必須抑制細胞內蛋白酶的分解作用；③由於細胞內有多種酶存在，往往有副產物形成，為防止副產物必須抑制其他酶活力；④細胞膜或細胞壁會造成底物滲透與擴散的障礙。
固定方法
細胞固定化培養技術主要利用包埋法來固定植物細胞，將植物細胞固定在各種不同的凝膠、薄膜以及多聚物的網孔內。海藻酸鈣由於其毒性相對低，操作簡單，是使用最多的包埋基質。除此之外，其他的膠類如瓊脂、瓊脂糖、凝膠、角叉藻膠和聚丙烯醯胺等也被使用。其他的包埋物如聚氨酯泡沫和中空纖維膜也可選用。用包埋法固定植物細胞，方法比較簡單，活性回收率比較高，固定化的植物細胞活性保持時間也較長。
此外，植物細胞常用的固定化方法還有聚氨基甲酸乙酯泡沫自然吸附法、自然的自固定化方法以及共價交聯法等。
細胞固定化培養技術按照其支持物不同可以分為兩大類：包埋式固定化培養系統，支持物多採用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯醯胺等；附著式固定化培養系統．支持物採用尼龍網、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。
常用細胞反應器
目前，植物細胞固定化培養常用的細胞反應器有以下兩種。
(1)平床培養系統本系統由培養、液罐和動泵等構成。新鮮的細胞被固定在床底部由聚丙烯等材料編織成的無菌平墊上。無菌液罐被緊固在培養床的上方，通過管道向下滴注培養液。培養床上的營養液再通過動泵循環送回。本系統設備較簡單，比懸浮培養體系能更有效地合成次生物質。不過它占地面積大，累積次生代謝物較多的滴液區所占比例不高；而且在這密封的體系中氧氣的供應時常成為限制因子，經常還得附加提供無菌空氣的設備。
(2)立柱培養系統本方法將植物細胞與瓊脂或褐藻酸鈉混合，製成一個個1～2 cm3的細胞團塊，並將它們集中於無菌立柱中。這樣，下滴的營養液流經大部分細胞，亦即“滴液區”比例大大提高，次生物質的合成大為增強，同時占地面積大為減小。
這一技術的優點在於：細胞位置的固定使其所處的環境類似於在植物體中所處的狀態，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利於次生產物的合成；由於細胞固定在支持物上，培養基可以不斷更換，可以從培養基中提取產物，免除了培養基中因含有過多的初生產物對細胞代謝的反饋抑制，也由於細胞留在反應器中，新的培養基可以再次利用這些細胞生產初生產物，從而節省了生產細胞所付出的時間和費用；正是由於細胞固定在一定的介質中，並可以從培養基中不斷提取產物．因此，它可以進行連續生產。可以較容易地控制培養系統的理化環境，從而可以研究特定的代謝途徑，並便於調節。
注意事項
植物細胞固定化培養時必須考慮以下幾個問題：
(1)所選用的植物細胞的次生代謝產物的產量是否很高，細胞生長速度是否較慢並能維持較長時間的生活能力；
(2)所選用的固定支持物對細胞的存活是否有影響，對產物的合成是否有阻礙；
(3)終產物是否能釋放到培養基中，如果產物不釋放到培養基中，是否能採用物理(電擊)或化學(離子滲透法)方法使其釋放而又不影響細胞生活力。
