基本介紹
- 中文名：植物細胞培養反應器
- 最初：採用微生物反應器
- 缺點：剪下力耐受性差
- 特點：周期長、細胞抗剪下能力弱
定義,類型及特點,條件,光照,激素,懸浮反應器,固定化細胞,選擇和設計,指標及配置,罐體系統,攪拌系統,通氣控制,溫度控制,泡沫控制,補料控制,pH控制,DO控制,壓力控制,控制系統,可擴展功能,技術,產業特點,作用,
定義
類型及特點
植物細胞培養具有周期長、細胞抗剪下能力弱、易團聚等特點；同時，植物細胞規模培養的目的是生產天然產物，而這些天然產物均為細胞生長代謝物。所以，植物細胞培養反應器的設計，不僅要考慮有利於細胞生長，同時還要考慮有利於產物的積累和分離。總體上講，適合植物細胞的反應器應該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪下力。根據不同植物細胞生長和代謝產物積累的特點，目前已研究設計出多種類型的反應器用於植物細胞培養。
反應器的選擇取決於生產細胞的濃度、通氣量以及所提供的營養成分的分散程度。根據通氣和攪拌系統的類型可將生物反應器分為以下幾類：
機械攪拌式生物反應器
機械攪拌式生物反應器有較大的操作範圍，混合程度高，適應性廣，在大規模生產中廣泛使用。攪拌罐中產生的剪下力大，容易損傷細胞，直接影響細胞的生長和代謝，特別對於次級產物生成影響極大。攪拌轉速越高，產生剪下力越大，對植物細胞傷害越大。對於有些對剪下力敏感的細胞，傳統的機械攪拌罐不適用。為此，對攪拌罐進行了改進，包括改變攪拌形式、葉輪結構與類型、空氣分布器等，力求減少產生的剪下力，同時滿足供氧與混合的要求。
Kaman等採用帶有1個雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和3個表面擋板的攪拌罐，證明適於剪下力敏感的高密度細胞培養。Jolicoeur等進行了類似的研究，在反應器中得到與搖瓶相同的高濃度生物量。鐘建江等通過培養紫蘇細胞進行比較，發現帶以微孔金屬絲網作為空氣分布器的三葉螺旋槳反應器(MRP)能提供較小的剪下力和良好的供氧及混合狀態，優於六平葉渦輪槳反應器，並認為在高濃度細胞培養時，MRP型反應器將顯示更大的優越性。離心式葉輪反應器(centrifugalimpellerbioreactor)與細胞升式反應器(cell-liftbioreactor)相比具有較高升液能力，較低剪下力，較短混合時間，在高濃度下具有高得多的溶解氧係數，表明有用於剪下力敏感的生物系統的巨大潛力。另有方框型槳式攪拌、蝶型渦輪攪拌等不同形式的機械攪拌罐用於植物細胞培養的生產和研究，結果證明不同葉輪產生剪下力大小順序為渦輪狀葉輪>平葉輪>螺旋狀葉輪。一種升流式生物反應器(lift-streambioreactor)利用罐中心一根連有多孔板的桿上下移動達到攪拌的目的，可用於培養剪下力敏感細胞。
非攪拌式生物反應器
相對於傳統攪拌式反應器，非攪拌式反應器所產生的剪下力較小，結構簡單，因此被認為適合植物細胞培養，其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器和轉鼓式反應器等。
通過對培養紫蘇細胞的生物反應器比較發現鼓泡式反應器優於機械攪拌式反應器。但由於鼓泡式反應器對氧的利用率較低，如果用較大通氣量，則產生的剪下力會損傷細胞。研究表明，噴大氣泡時，湍流剪下力是抑制細胞生長和損害細胞的重要原因。較大氣泡或較高氣速導致較高剪下力，從而對植物細胞有害。
氣升式反應器廣泛套用於植物細胞培養的研究和生產。通過胡蘿蔔細胞培養研究發現，比較攪拌罐、氣體噴射罐和帶通氣管的氣升式反應器，最高細胞濃度和最短倍增時間可從氣升罐中得到。氣升式反應器用於多種植物細胞懸浮培養或固定化細胞培養，但其操作彈性較小，低氣速時，尤其H/D大，高密度培養時，混合性能欠佳。過量供氣，過高的氧濃度反而會影響細胞的生長和次生代謝產物的合成。將氣升式發酵罐與慢速攪拌結合使用可彌補低氣速時混合性差的弱點，採用分段的氣升管，也有利於氧的利用與混合。
轉鼓式反應器用於菸草細胞懸浮培養的研究發現，與有一個通風管的氣升式反應器相比，相同條件下轉鼓式反應器中生長速率高，其氧的傳遞及剪下力對細胞的傷害水平方面均優於氣升式反應器。
光生物反應器
許多植物細胞培養過程中需要光照，往往考慮在普通反應器基礎上增加光照系統，但在實際中存在很多問題，如光源的安裝、保護，光的傳遞，還有光照系統對反應器供氣、混合的影響等。小規模實驗往往採用外部光照，反應器表面有透明的照明區，光源固定在反應器外部周圍。但大規模生產時透光窗的設定，內部培養物對光的均勻接受等問題難以解決，因此許多人對採用內部光源的反應器進行了研究。
Mori等發明的反應器將多個透明圓柱體平行安裝在反應器罐內，光源放置在透明圓柱體中，供給CO2的氣體交換器在罐內兩個圓柱之間。Ogbonna等研製了一種用於大規模培養光合細胞的新型內部光照攪拌式光生物反應器，它由每個單元都包含光源的多個單元組成。大的光生物反應器通過增加單元數目得到。每個單元中心固定一個玻璃管，光源插入其中，由攪拌槳實現混合，該攪拌漿設計成旋轉時不接觸玻璃管，玻璃管同時作為擋板，該反應器在低轉速下仍有較高混合程度，而且剪下力較小。由於發光體並非機械固定在反應器上，且通過玻璃管與發酵液分離，因此反應器可高壓滅菌，而發光體在冷卻後插入玻璃管。Yamamurak等研究固定CO2的光反應器，特別之處在於攪拌器具有發光作用。
其他新型反應器
根據植物細胞的特性，許多有別於傳統微生物反應器的新型反應器正用於植物細胞的研究生產，如各種固定化植物細胞反應器和膜反應器等。Dubuis等用新型環回式流化床反應器(loopfluidizedbedreactor)進行coffeaarabica培養，測定了生長和產物合成的動力學參數，認為該反應器操作方便，消除了氣體直接噴射引起的剪下力，易於測定放大所需的參數，適合中試和工業化生產。Nagai等用固定床反應器培養固定化菸草細胞，生長速率與搖瓶相同，胞內合成與搖瓶無明顯區別。
Tyler等報導了一種植物細胞表面固定化培養系統，避免了傳統攪拌罐懸浮培養中的流體流動力或剪下力問題，並促進植物細胞凝聚的特性，使次級代謝產物合成和積累增加，而且該系統培養基交換簡單，次級產物提取容易。Lang也研究了植物細胞膜反應器，將細胞固定在膜上3mm厚一層，培養基在膜下封閉迴路循環流動，營養透過膜擴散至細胞層，次級代謝物分泌透過膜擴散至培養基。
Humphrey對植物細胞培養微孔膜通氣反應器進行了研究，分析了氧傳遞，為需要小剪下力的植物細胞培養的膜通氣反應器提供設計依據，設計應考慮的因素包括管的長度、直徑和膜厚度，進氣的組成和壓力，細胞生長培養階段等。
條件
光照
離體培養的植物細胞對光照條件不甚嚴格，因為細胞生長所需要的物質主要是靠培養基供給的。但光照不但與光合作用有關，而且與細胞分化有關，例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用，所以以獲得植株為目的的早期植物細胞培養過程中，光照條件特別重要。以植物細胞離體培養方式獲得重要物質，如藥物的過程，植物細胞大多是在反應器中懸浮培養。
激素
植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節，促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物細胞的分裂，生長，分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節。和動物細胞相比，植物細胞離體培養對激素要求的原理已經了解，其套用技術也已相當成熟，已經有一套廣泛作為商品使用的培養液。同時解決了植物細胞對水、營養物、激素、滲透壓、酸鹼度、微量元素等的需求。
懸浮反應器
機械攪拌生物反應器
儘管機械攪拌反應器已成功用於許多細胞的培養中，反應器內的溫度、pH、溶氧及營養物質濃度較其他反應器更易控制等優點，但由於機械攪拌造成的剪下力以對植物細胞造成較大的損傷，對次級代謝產物的合成也會產生影響，同時會帶來染菌和機械上的問題，因此需篩選出抗剪下力的細胞系，也可對反應器結構進行改造，尤其是攪拌槳的結構和類型的改進，使其具有緩和、充分的攪拌效果。
非機械攪拌式反應器
植物細胞的培養比較多地採用各種非機械攪拌生物反應器，其中常用的是氣體攪拌生物反應器。氣體攪拌生物反應器沒有活動的攪拌裝置，在很大程度上減少了剪下力，並能在長期操作中保持無菌。氣體攪拌生物反應器包括鼓泡塔和氣升式反應器等。氣體攪拌生物反應器結構較簡單，氧傳遞效率高，剪下力低，對細胞的損傷小，容易實現長期無菌培養，較適用於植物細胞培養。
缺點：操作彈性小，低氣速時尤其在培養後期細胞密度較高時，混合效果較差。如果提高通氣量，又會產生大量泡沫，也易於驅除培養液中的二氧化碳和乙烯，對細胞生長有阻礙作用。過高的溶氧對植物細胞合成次級代謝產物不利。
固定化細胞
填充床生物反應器
細胞可以位於支撐物表面，也可包埋於支撐物之中，培養液流經支撐物顆粒，不斷被細胞利用。優點：單位體積固定細胞量大。缺點：混合效果低，對必要的氧傳遞、pH、溫度控制和氣體產物的排除造成困難，影響細胞的培養。
流化床生物反應器
利用液體的能量來懸浮顆粒。顆粒呈流化狀態所需的能量與顆粒大小成正比，因此常採用小固定化顆粒，這些小顆粒良好的傳質特性是流化床反應器的優點，缺點：剪下力和顆粒碰撞會損壞固定化細胞。
膜生物反應器
採用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細胞。營養物質通過膜滲透到細胞中，細胞產生的次級代謝產物通過膜釋放到培養液中。主要有：中空纖維反應器和螺線式卷繞反應器，優點：可以重複使用。
選擇和設計
植物細胞反應器的選擇和設計需注意：
1. 氧的供給對於間歇培養，體積溶氧係數klα需要10-15h-1;
2. 剪下力反應器的剪下力儘可能小；
3. 細胞的黏附細胞培養過程容易黏附在反應器壁上，並產生大量的泡沫，導致細胞量和代謝產物減少，嚴重時培養過程被迫中止；
4. 細胞高密度培養時，混合情況變差，培養基中營養物質和氧的供給不足，細胞收率下降；
5. 溫度、pH、營養物質的濃度須控制在合適的範圍內。
指標及配置
罐體系統
罐蓋和罐底採用SUS316L優質不鏽鋼，罐體採用耐高溫矽硼玻璃，裝液係數70%，工藝結構先進，操作簡單。
攪拌系統
採用上懸掛強磁力攪拌系統，無機械密封不易泄漏，底部無頂針，採用優質鋁合金馬達及進口調速器確保轉速穩定；高性能攪拌槳、消泡槳，無級調速。罐內件全部安裝在罐蓋上，維護、清洗十分方便;發酵專用標準槳，槳片高度可調，亦可根據發酵工藝的特殊要求更換不同類型的攪拌槳。馬達與罐體分離的設計使罐體重量大大減輕，操作更加輕鬆方便，節省了大量人力。磁力攪拌系統採用特殊永磁材料，特有加工工藝，永不褪磁，最高攪拌轉速在發酵罐壽命期限內不會低於980rpm，在高粘度介質中亦可達到最高轉速，全自動設定控制範圍50~1000rpm±5rpm。
通氣控制
手動控制，流量計顯示。包括轉子流量計、進口濾膜空氣除菌過濾器，過濾精度高達0.02μm
溫度控制
夾套水浴電加熱，自動控制，溫度控制冷卻水溫度+5℃~65℃±0.2℃
泡沫控制
全自動PID測控與報警，蠕動泵自動添加消泡劑
補料控制
PID全自動設定蠕動泵開關控制，自動流加並計量。
pH控制
採用瑞士原裝進口梅特勒電極（兼容高質量國產電極），蠕動泵自動添加酸、鹼，精確控制pH，顯示範圍：0.00~14.00±0.01，全自動控制範圍：2.00~12.00±0.05
DO控制
採用瑞士原裝進口梅特勒電極（兼容高質量國產電極），與轉速（空氣流量、補料等可選）關聯控制，0-150±3%，顯示精度0.1%
壓力控制
手動控制（自動控制可選），儀表顯示
控制系統
單罐可採用BIOTECH-2002生物過程控制器輔以BIOTECH-FCS發酵監控軟體是您既能在現場實地觀察發酵變化也可對發酵過程實施遠程監控；若採用多聯或多級發酵罐則可採用BIOTECH-3000生物過程控制器實現更多測控功能。（更多控制功能請參見相關生物過程控制器及發酵監控軟體的介紹）
可擴展功能
a空氣流量、罐壓、液位自動檢測控制；b排氣O2、CO2檢測；c可增加兩路補料；d可增加電子天平稱重系統
技術
培養中的植物細胞特性
植物細胞的大規模培養技術是在微生物生物反應器技術的基礎上建立起來的，但是植物細胞培養過程的操作條件與微生物培養具有較大的差異。這些差異主要表現在：a、植物細胞的體積與微生物相比要大得多，其平均直徑是微生物細胞的30-100倍。b、植物細胞很少單細胞的形式懸浮生長，通常是以直徑2mm大小的多細胞團方式存在於培養系統中，由於組成細胞團的細胞數量差異，容易在培養系統中形成非均勻相的集合細胞團。c、植物細胞的纖維素細胞壁雖然使細胞具有很強的抗張強度，卻使其抗剪下的能力相當弱。d、植物細胞生產速度慢，因此操作周期廠，因此，植物細胞培養中維持無菌環境的難度也較大。
植物小培養液的流變特性
對細胞培養液的流變特性的研究資料很少，人們常常用黏度來描述培養的流變學特性。培養過程中培養液的黏度變化可由細胞本身和細胞分泌物引起。
植物細胞培養過程的O2與CO2調節
所有植物細胞都是好運氣的，培養過程中需要連續不斷地供氧。由於植物細胞對溶氧的變化非常敏感，太高或太低均會對培養基過程產生不良的影響，因此，大規模植物細胞培養對供氧和尾氣氧的監控十分重要。氧氣從氣相到細胞表面的傳遞是植物細胞培養中的一個基本問題。
泡沫和表面黏附性
植物細胞大規模培養中易產生大量的泡沫，且覆蓋有蛋白質和黏多糖，因而黏性大，細胞極易被包埋其中從循環的培養液中帶出來，形成非均相培養，從而影響系統的穩定性和生產率。
剪下力對植物細胞的影響
在大規模的培養中，植物細胞對剪下力的敏感性一直能夠是力求解決的重要技術問題之一。流體剪下力對植物的影響包括正負兩方面。適當的剪下力可以增加培養系統的通氣性，保持良好的混合狀態和分散性，從而提高細胞的生物量和增加此生產物的積累。但在細胞能夠忍受的剪下力範圍之內，生物反應器增家剪下的設計往往比降低剪下力要容易。因此，目前細胞的研究大多集中在剪下力對植物細胞的傷害這一問題上。
產業特點
產值不大作用大
生物反應器產業本身很難有每年達數十億元的產值，但其在生物技術產業鏈中卻起著再生產和擴大再生產的作用，達上百億元以上。有時一個新的生物反應器技術的套用和推廣，就可能促進某一生物技術產品的產業化形成，提高生產能力，或降低生產成本，可節約能耗達數十億元之巨。
產品多樣性
目前用於生產的細胞和生物材料有微生物、動植物細胞、藻類、各種酶類等。不同細胞或酶有不同特點，因而有不同生物反應器設計要求。
生物反應器種類有氣升式反應器和機械攪拌反應器；常規反應器和光生物反應器；好氧和厭氧反應器；液體深層培養反應器和固體發酵反應器；根據不同機械結構劃分的反應器；不同控制原理劃分的反應器等。此外，生物反應的規模也可由幾十毫升到上百M3不等。
很難規定幾個通用產品進行大批量生產，大多數用戶根據自己的研究或生產特點，提出不同的定貨要求，反應器研製廠家必需有足夠的技術力量和經驗進行非定型化設計，以滿足用戶要求。
生物過程最佳化與放大技術
具有先進的生物過程最佳化和放大能力是生物反應器設計的核心技術。由於在生物反應器中所發生的反應是在分子水平的遺傳特性、細胞水平的代謝調節和反應器工程水平的混和傳遞等多尺度（水平）上發生的。因此，如何利用生物反應器中的多參數檢測技術和線上計算機控制與數據處理技術，把細胞在反應器中各種表型數據與代謝調控有關的基因結構研究關聯起來，是反應器過程最佳化與放大的重要內容，也是當前國內外競相發展的具有原創性的智慧財產權技術，對促進生物技術產業化發展具有重要意義。由此可見，提供包含以上功能並具有自主智慧財產權的商品化生物反應器應是我國生物反應器產業的重點之一。
生物技術發展要求性能更高的生物反應器
為了適應各種生物技術的實驗室成果向產業化轉化的需要，對生物反應器的性能要求愈來愈高，目前主要表現為：
用於基因工程高密度高表達，符合GMP標準的生物反應器以及一些新技術的套用等。其中關於供氧問題，快速升溫、SIP自動滅菌、CIP自動清洗、機械密封、排氣處理、取樣處理等問題以及培養液成份的流動注射分析（FIA）分析等都需很好解決。
哺乳類動物細胞大規模培養是當前生產高附加值的糖基化活性蛋白醫藥產品的重要發展趨勢。根據動物細胞無細胞壁，對剪下極端敏感，在細胞生長控制上，要防止細胞分化和細胞凋亡，有時還要考慮對產品糖基化質量的要求。所以反應器要具備低剪下效應，混合性能好等特點，要提供細胞形態線上觀察和活細胞數量的感測技術，嚴格控制反應器的操作條件以及有關防污染的灌注系統、取樣系統等都需要研究解決。
用於細胞過程生理特性和過程傳遞特性研究的生物反應器研製，其中主要解決用於過程分析的各種感測器選型研製和數據處理軟體包的研製。特別是近年來隨著微生物基因組測序和系統生物學研究工作的深入展開，發酵過程檢測與控測已經從基於參數感測技術的反饋控制發展為以信息處理為基礎的生物過程檢測與分析。各種譜分析與生物反應器實驗數據關聯起來，提供各種表型數據具有重要意義。因而對反應器設計提出了新的要求。
隨著生物技術在各領域的推廣套用，用於海洋藻類、微生物肥料、微生態飼料、環境污染處理等大規模細胞培養需要高強度低造價的生物反應器。特別是近年來利用生物質生產燃料乙醇等能源物質的戰略部署，需要套用大型高效節能生物反應器降低生產成本。
產品型號更新換代與部件技術研究
生物反應器是多專業技術發展的綜合體，由於反應器零部件技術的進步，必須及時更新產品設計，為用戶提供性能更好且價格合理的反應器產品。這些零部件技術包括計算機軟硬體技術、各種感測技術、反應器流型設計，新機械結構和材料等等。此外，隨著信息處理技術的發展，如何實現大批量數據處理、貯存與通信，把生物信息學與過程信息結合起來實現複雜生物系統的分析與控制，也以軟體包的形式逐漸從實驗室研究走向商品化。
產品生產的標準化、規範化
作為商品化裝置的市場化，建立生物反應器生產標準，實施IS09001管理是發展生物反應器產業的重要內容，只有這樣才能提供合符用戶要求及質量穩定的產品。主要內容有：
產品裝置成套加工的工藝技術路線的確定與質量控制研究。在生物反應器製造過程中，如材料、焊接、表面處理、零部件機加工、外購件、易耗品…、直到安裝流程工藝、器材倉庫管理…等都要嚴格實施質量檢驗；
原材料、半成品、成品標準等的確立與實施。如有關感測器及一些如空氣過濾器、閥件、質量流量計等關鍵部件的測試標準的建立與研究，整機性能測試標準的建立與研究；
產品質量過程控制程式的確立與實施等；整機性能測試標準的建立與研究。
高品質的售後技術支持
由於生物反應器中的反應是在基因、細胞和反應器工程水平上多尺度發生的，因而真正利用生物反應器實現過程最佳化是有難度的，從理論到實踐的提高，並進一步在生物技術產品生產中發揮作用，需要有一個過程，應該把售前宣傳和售後服務等與整體套用技術提高結合起來才能取得好的效果。
作用
許多實驗證明，在植物細胞培養過程中，抑制細胞生長和損傷細胞的主要是剪下力，而不是氧供應不足，相反，過高的氧濃度往往抑制細胞生長和產物合成。提高混合程度，減低剪下力，是目前設計適於植物細胞培養反應器的主要原則，但如果能提高植物細胞對剪下力的耐受程度，將大大簡化反應器的選擇和設計問題。很多情況下，剪下力抑制產物的合成，但對生長影響不大，探討其機理有助於採取相應措施解決。對於需要光照的細胞，還要考慮光源的設定、光傳遞及光的產熱問題。 不同植物細胞的特性，如對剪下力的耐受性、結團情況、倍增時間、對氧和光的需求等各不相同，沒有哪種反應器能滿足所有植物細胞的要求，實驗中應根據細胞特性採用合適的反應器，進一步研究各種植物細胞和不同反應器中流體力學的性質，可為選擇和設計植物細胞培養反應器提供可靠的依據。
