實時螢光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以螢光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。·
Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過螢光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存線上性關係，所以成為定量的依據。
基本介紹
- 中文名：實時螢光定量多聚核苷酸鏈式反應
- 外文名：Real-time Quantitative polymerase chain reaction
- 中文簡稱：實時螢光定量PCR
- 外文簡稱：qPCR
原理,技術原理,Ct 值,螢光化學物質,傳統定量PCR,實時螢光定量PCR,實時螢光定量PCR的定量方法,相關套用,臨床疾病診斷,動物疾病檢測,食品安全,科學研究,套用行業,關於名稱,
原理
所謂實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴增螢光曲線圖
PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
服務流程
1.客戶認真寫好訂單，提供待檢基因相關信息；
2.簽訂技術服務契約，支付預付款（30-50%)；
3.設計合成定量PCR引物（或客戶提供文獻引物委託本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉錄；
5.PCR預實驗，主要檢測引物的特異性和擴增效率；
6.正式定量實驗：對所有樣品上機檢測；
7.實驗結果和數據分析，形成報告。
收費標準
優惠包乾價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）
（含RNA提取，反轉錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重複）；一個內參免費（內參3個重複）
技術原理
將標記有螢光素的Taqman探針與模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，螢光素游離於反應體系中，在特定光激發下發出螢光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化螢光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。
Ct 值
Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的含義為：每個反應管內的螢光信號到達設定閾值時所經歷的循環數
圖1（如圖1所示）。
1. 螢光閾值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，螢光閾值的預設（默認）設定是3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值與起始模板的關係
每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存線上性關係，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為螢光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。
螢光化學物質
1. TaqMan螢光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台。
2. SYBR螢光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料非特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個鹼基左右的髮夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致螢光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生螢光。PCR產物生成後，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，螢光基因與淬滅基因分離產生螢光。
傳統定量PCR
1．傳統定量PCR方法簡介
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用螢光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其螢光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為螢光標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定螢光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用
3．內標對定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
實時螢光定量PCR
實時螢光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次螢光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時螢光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時螢光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
實時螢光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和絕對定量。
相關套用
臨床疾病診斷
各型肝炎、愛滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合症、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標誌物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。
動物疾病檢測
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食品安全
食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。
科學研究
醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。
套用行業
各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。
關於名稱
根據MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指導方針，qPCR為Quantitative real-time PCR的簡稱，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR僅用來表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少數作者並沒有堅持這一原則。
