印跡轉移

印跡轉移指將電泳分離後的生物樣品區帶從凝膠中原位轉移到固相支持物上的過程。轉移過程中，生物樣品的相對位置保持不變，可以永久性地重現生物樣品在凝膠中的位置，便於下一步的檢測。固相薄層支持物常用硝酸纖維素膜或尼龍膜。尼龍膜比硝酸纖維素膜有更強的結合蛋白質的能力，但非特異性地結合抗體蛋白較明顯，在免疫固定染色易形成高背景，故硝酸纖維素膜常作為蛋白質印跡轉移到首選材料。自1975年建立印跡法以後，套用較成熟的方法有Southern,Northern和Western法，它們分別用於DNA、RNA和蛋白質樣品的分析。用電泳轉移印跡和真空轉移印跡技術可提高印跡效率，縮短印跡轉移時間。

基本介紹

• 中文名：印跡轉移
• 定義：生物學實驗方法
• 時間：1975年
• 人物：Southren

具體套用

Alwine等將類似方法用於RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設計了將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等製成夾心餅乾狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。1982年Reinhart等用電轉移法將等電聚焦後的蛋白質區帶從凝膠轉移到特定膜上，稱Eastern印跡。

國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快效率高、重複性好，套用更加廣泛。聚丙烯醯胺凝膠也可用於印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用於轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。

進行印跡轉移電泳時，要注意緩衝液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩定性較好的Tris-緩衝體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。

印跡轉移緩衝液必須具備有效地將蛋白和核酸從凝膠基質中洗脫和與膜結合這兩個條件。有3 種轉印緩衝液 可供選擇：10x Tris/ 甘氨酸、10x Tris/CAPS 和20x SSC。使用預混合的洗滌液和封閉劑可使蛋白和核酸的轉印過 程變得更加簡單。溶於PBS、TBS 和SSC 的預混合洗滌緩衝液減少了儲備液的製備。預混合封閉緩衝液有1x PBS/乾酪素和1 x TBS/ 乾酪素兩種。可節省溶解酪素所需的時間和精力。

原理和最佳化

印跡轉移蛋白質從凝膠轉移到膜上的過程中同時保持它們的相對位置和解析度，這被稱為印跡。印跡可以以三種不同的方式實現：

印跡轉移

簡單擴散：將膜放在凝膠上，同時放一沓乾濾紙在乾膜上，並在濾紙上放置重物以加快擴散過程。這種方法可用於將蛋白質從一塊凝膠上轉移到多個膜上，同一凝膠可得到幾個印跡膜。擴散法的主要缺點是不能定量轉移，與電轉比較只能轉移25-50%的蛋白質。

真空輔助溶劑流動：用泵的吸力將分離的蛋白質從凝膠轉移到膜上，高低分子量的蛋白質都可以用這種方法轉移；然而，分子量小於14KD的蛋白質需要用較小孔徑的膜（0.2um），因為它們不易被0.45um膜吸附。很少從聚丙烯醯胺凝膠中真空轉印蛋白質，而從瓊脂糖中轉移核酸則常用此法。

電洗脫或電轉移：最常用的轉移方法，與擴散或真空印跡相比，其主要優點是速度和轉移更完全。

電轉移方法

兩種常用的電轉移方法是濕轉和半乾轉。兩者的原理完全相同，只是用於固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。濕轉是一種傳統方法，將膠/膜疊層浸入緩衝液槽然後加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩衝液且只能用一種緩衝液。另外用這種方法轉移2-D電泳中常規使用的大膠比較困難。濕轉系統一般在恆壓條件下進行，轉移過程中混合緩衝液保持電流相對恆定。半乾轉移，用浸透緩衝液的多層濾紙代替緩衝液槽。因為電極板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強度儘可能大以快速高效轉移。與濕轉相比，這種方法又快（15-45分鐘）又好。多數半乾轉移方法使用一種以上的緩衝系統，可以同時高效轉移大小不同的蛋白。然而，半乾印跡系統因緩衝液較少不適於較長時間轉移。對於大2-D膠的印跡，半乾轉移是理想選擇。半乾印跡儀一般使用恆流條件，轉移過程中電壓逐漸增加。半乾轉移系統中，濾紙和膜切成和凝膠相同大小，這樣電流必須通過凝膠，否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導致電流短路。兩種轉移系統中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡。氣泡阻礙轉移並在印跡膜上產生“禿斑”（即非轉移區）。

轉移緩衝液印跡轉移轉移緩衝液提供電極之間的電連線，必須能夠導電。同時它也提供一種化學環境保證蛋白溶解，而不需擔心蛋白質在轉移過程中不能吸附到膜上。常規配方可滿足多數蛋白樣品的需要。多數緩衝液在轉移過程中產生熱量。針對此原因，很多濕轉裝置配備嵌入式冷卻線圈。濕轉也可在冷室中進行，緩衝液使用前可預冷。半乾轉移中電極板起到散熱器功能。但它們的散熱能力有限，一般半乾轉移不能進行太長時間。 傳統轉移緩衝液由緩衝系統和甲醇組成。Towbin緩衝液，一種Tris-甘氨酸緩衝液，常用於濕轉系統。該緩衝液PH為8.3，比大多數蛋白質的等電點（pI）要高。蛋白質帶淨負電荷並向陽極遷移。因為緩衝液在槽中混合，轉移過程中離子分布相對穩定。

印跡轉移

半干係統使用三緩衝液系統。使用三種緩衝液是因為轉移是等速電泳過程，蛋白質在前導離子和尾隨離子之間遷移。三種緩衝液是：

陽極緩衝液Ⅰ：0.3M Tris, PH 10.4陽極緩衝液Ⅱ：25mM Tris, PH 10.4 陰極緩衝液：25mM Tris, 40mM ε-氨基乙酸，PH 9.4陽極緩衝液Ⅰ中和陽極板表面產生的過量質子。陽極緩衝液Ⅱ含與陽極緩衝液Ⅰ相同的PH,但Tris濃度降低到25mM。陰極緩衝液含ε-氨基乙酸，轉移過程中作為尾隨離子，隨著蛋白穿透凝膠遷移到陽極不斷被消耗掉。

通常不推薦用單緩衝液代替三緩衝液系統。單緩衝系統中整個凝膠轉移有不一致的趨勢，且經常轉移不徹底。

儘管上述緩衝液系統適用於大多數蛋白轉移，文獻中還有很多適於不同套用的變化類型。最明顯的變化之一是推薦10mM CAPS緩衝液（PH 11）用於蛋白質測序。在使用Edman化學法進行自動蛋白質測序時，Towbin緩衝液以及凝膠電泳緩衝液中的甘氨酸會引起高背景。改變緩衝液成分可以顯著降低這種影響。對緩衝強度和組成的任何修飾都應非常注意，確保轉移裝置不會過熱。