《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》是廣東溢多利生物科技股份有限公司於2010年11月24日申請的專利，該專利的公布號為CN102002471B，授權公布日為2012年7月4日，發明人是羅長財、吳迪、汪雲飛、張娟、陳麗芝、謝建華。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種產木聚糖酶的菌株Escherichia coli，和從該菌株中得到的一種新型木聚糖酶V-XYL及其高效表達的方法和套用。該發明提供一種來源於Escherichia coli（保藏編號是：CGMCC No.4234）的木聚糖酶，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且該發明提供了編碼上述木聚糖酶的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。該木聚糖酶的最適溫度為60℃，最適pH值為5.0，在酸性範圍內具有良好的pH穩定性，具有良好的抗蛋白酶的能力。該發明還提供了該木聚糖酶基因高效表達的方法，其表達量可達到100000每毫升以上，其固體酶製劑具有良好的穩定性，可用於飼料、石油化工、釀酒工業中。
2018年12月20日，《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》獲得第二十屆中國專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用
- 公告號：CN102002471B
- 授權日：2012年7月4日
- 申請號：2010105662274
- 申請日：2010年11月24日
- 申請人：廣東溢多利生物科技股份有限公司
- 地址：廣東省珠海市南屏科技工業園屏北一路8號
- 發明人：羅長財、吳迪、汪雲飛、張娟、陳麗芝、謝建華
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I; C12N9/42(2006.01)I
- 代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
- 代理人：高宇、楊小蓉
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
木聚糖是植物細胞壁的主要成分之一，廣泛存在於常用植物性飼料原料（玉米、小麥、菜粕和棉粕）中，屬於非澱粉多糖（Non-starch polysaccharides，NSP），是飼料中的主要抗營養因子之一。通常根據溶解性可分為水溶性木聚糖和不溶性木聚糖。大量研究證實可溶性木聚糖可增加小腸內容物粘度，從而阻礙營養物質與消化酶結合及營養物質在小腸黏膜上的消化吸收，而且粘度的增加會抑制內源消化酶的活性，降低食靡的通過速度，降低動物採食量，增加胃腸代謝和內源損失。此外，植物原料中不溶性木聚糖包裹澱粉、蛋白質等營養物質，阻止營養物質與消化酶的接觸，降低營養物質的消化率。因此，消除木聚糖的抗營養作用對進一步提高飼料資源利用率、拓寬飼料資源和提高養殖經濟效益具有重要意義。
木聚糖酶是專一降解木聚糖的一類酶，對木聚糖酶的研究發現，它套用於飼料中通過降解木聚糖抗營養因子，可提高飼料營養價值以及動物對飼料的利用率，從而降低了飼料成本，減少飼料浪費；另外還減少了動物排泄物造成的污染等。因此，木聚糖酶作為一種環保添加劑，在發展綠色環保型畜牧養殖業中具有十分重要的意義和價值。
截至2010年11月24日，隨著人們對畜產品品質安全衛生的要求，開發使用高品質無毒、無害和無污染殘留的綠色飼料添加劑已成為中國飼料工業面臨的一個緊迫問題。中國飼料產量位居世界第二，然而飼料資源並不豐富，其中能量飼料缺口較大，據預測在2010～2020年將達0.43億噸。規模化養殖的發展，使充分利用非常規飼料資源成為畜牧業長期、持續和健康發展的關鍵。中國長期以玉米為主要能量飼料原料的現狀造成玉米供應日趨緊張，因此必須充分地開發利用資源豐富的麥類、穀物和糠麩。但麥類、穀物和糠麩等副產品中都存在抗營養因子-木聚糖，限制了其在飼料中的大量套用。隨著生物技術的發展，飼用酶製劑和微生物製劑的產量得到了快速增長，質量也有了顯著提高，酶製劑可以提高飼料利用率、促進動物生長、改善生態環境和防治動物疾病，避免了由於添加抗生素、激素和高銅等物質所產生的負面影響，具有明顯的經濟效益和積極的環保意義。中國飼料行業，在配合飼料中除一般玉米一豆粕型日糧，實際上更多的情況是在玉米一豆粕型日糧基礎上可能加入10％-40％的大麥或小麥、次粉、麥麩、統糠、棉粕等非常規飼用原料，這使得木聚糖酶在飼料工業中占有重要地位。另外，中國已加入WTO，中國以外低價格小麥、大麥產品的湧入，將進一步刺激木聚糖酶的市場需求。添加以木聚糖酶為主的飼用酶製劑，消除抗營養因子的抗營養作用，市場前景極為廣闊。
木聚糖酶是能專一性降解木聚糖為小分子的還原糖的一組酶的總稱，主要包三類：1）β-1，4，D-內切木聚糖酶，從木聚糖主鏈的內部切割β-1，4-糖苷鍵，使木聚糖溶液的粘度迅速降低；2）β-1，4-D-外切木聚糖酶，以單個木聚糖為切割單位作用於木聚糖的非還原性末端，使反應體系的還原性不斷增加；3）β-木糖苷酶，切割低聚木糖和木二糖，有助於木聚糖徹底降解為木糖。木聚糖酶破壞木聚糖分子中的共價交聯及通過氫鍵形成的連線區，使用使木聚糖的水溶性大大下降，從而降低對腸道的負作用。具體功能如下：
1、降低胃腸道食糜的粘性，促進動物生長及提高飼料利用率；
2、提高內源性消化酶的活性，促進養分的消化吸收；
3、減少腸道微生物數量，有利於畜禽的健康；
4、破壞植物細胞壁結構，減少糞便，降低污染。
對木聚糖酶的研究早在60年代就已開始，已經從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同性質的木聚糖酶。木聚糖酶套用於飼料中提高了飼料營養價值，突破了飼料資源開發利用的局限，增強了動物的生產與抗病能力，減少了動物排泄物造成的污染，作為一種綠色環保飼用酶製劑，在發展環保型畜牧業中具有十分重要的意義與價值，近年來已成為國內外研究的熱點之一。大量有關木聚糖酶結構與功能的研究不斷展開，一方面加深了對木聚糖酶作用的了解，另一方面為通過基因工程和蛋白質工程改良木聚糖酶的性質、研製出符合不同套用領域要求的木聚糖酶產品提供了指導。
篩選到更多的符合工業化生產的木聚糖酶基因是木聚糖酶更好的產業化的方法之一。截至2010年11月24日，中國國內外木聚糖酶的研究及生產主要為黴菌，也有採用畢赤酵母的報導，其基因來源主要也是真菌類，如黑麴黴、米麴黴等。而大腸桿菌來源的木聚糖酶的功能研究及生產套用還未有報導。
發明內容
專利目的
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的目的是提供一種產木聚糖酶的大腸桿菌Escherichiacoli，其保藏號為：CGMCCNo.4234。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供一種來源於上述大腸桿菌的木聚糖酶。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重組載體。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重組菌株。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供一種高效表達上述木聚糖酶的方法。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的再一目的是提供上述木聚糖酶的套用。
技術方案
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》從自然環境中篩選到一種天然菌株，大腸桿菌Escherichiacoli，該菌株於2010年10月20日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏中心地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），其保藏編號是：CGMCCNo.4234。
從上述菌株中分離得到了一種木聚糖酶V-XYL，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MVSRHLCSSR | DLTSFKVTGN | KVGTIGGVGY | ELDMGSLNSA | TFYSDGSFSC |
TFQNAGDYLC | 60 | |||
RSGLSFDSTK | TPSQRILKIS | FRGLVKQNSS | NVGYSYVGVY | GWTRSPLVEY |
YIVDNWLSPF | 120 | |||
PPGDGFEGSK | HGSFTIDGAQ | YTVYENNSRT | VCYDGDTTFN | QYFSIRQQAR |
ACVYQPLIVF | 180 | |||
FDQWEKLGMT | MGKLHEAKVL | GEAGNVNGGA | SGTADFPYAK | VYIDDIRSQV |
IRRIKTS | 237 |
該酶基因編碼237個胺基酸，N端沒有信號肽序列，其理論分子量為26.2kDa，該木聚糖酶的最適溫度為60℃，在60℃下處理60分鐘，酶活性維持在60％以上，在70℃下處理10分鐘，酶活性還能維持在50％以上，最適pH值為5.0，在pH為3.0～7.0的條件下處理4個小時，酶活性均維持在85％以上，用人工胃液和腸液處理90分鐘，酶活性均維持在80％以上，說明該酶具有良好的抗蛋白酶的能力，將該木聚糖酶製備成為固體酶製劑，在室溫條件下保存12個月，酶活性維持在90％以上，說明該酶製劑具有良好的穩定性，適於工業生產和套用。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》還提供了編碼上述木聚糖酶的基因V-XYL，該基因的序列如SEQ ID NO.2所示：
atggtaagtc | gacatctatg | ttcaagtaga | gatctcacgt | ctttcaaggt | aaccggcaac | 60 |
aaggttggaa | ctattggtgg | tgttggttac | gaattagata | tgggtagcta | gttgaacagt | 120 |
gctactttct | attctgatgg | ttccttctca | tgtactttcc | aaaatgctgg | ggattactta | 180 |
tgtcgtagtg | gtctttcttt | cgatagtact | aagaccccat | ctcagcgtat | actgaaaatt | 240 |
agtttcagag | gtcttgtcaa | acaaaatagt | tccaatgttg | gttattccta | tgttggtgtt | 300 |
tacggttgga | ctagaagtcc | acttgtcgaa | tactacattg | tcgataattg | gcttagtcca | 360 |
ttcccaccag | gtgacggatt | tgaaggtagt | aagcatggtt | ctttcactat | tgatggtgct | 420 |
caatacactg | tttatgaaaa | caactctcgt | actgtctgct | atgatggtga | taccaccttc | 480 |
aatcaatact | ttagtattcg | tcaacaagct | cgtgcatgcg | tttatcaacc | attgattgtg | 540 |
ttctttgatc | aatgggaaaa | gcttggtatg | actatgggta | aattacatga | agccaaggtt | 600 |
ttaggtgaag | ccggtaacgt | taacggtggt | gccagtggta | ccgctgattt | cccatacgca | 660 |
aaggtttaca | ttgacgacat | aagaagtcag | gtcatcagaa | ggattaaaac | ttcttag | 717 |
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》通過構建DNA文庫的方法分離得到上述木聚糖酶基因V-XYL，該基因全長717bp，根據該基因推導出的胺基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，結果表明其胺基酸序列與來源於產琥珀酸絲狀桿菌Fibrobacter succinogenes及單中心真菌Neocallimastix patriciarum表達的木聚糖酶具有較高的一致性，說明該木聚糖酶V-XYL是一種新的木聚糖酶。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》還提供了包含上述木聚糖酶基因V-XYL的重組載體，優選為pPICzaA-V-XYL。將《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連線。作為《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的一個最優選的實施方案，優選為將《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的木聚糖酶基因插入到質粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-V-XYL。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》還提供了包含上述木聚糖酶基因V-XYL的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵母菌株X33。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》還提供了一種高效表達上述木聚糖酶V-XYL的方法，包括以下步驟：1）用上述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；2）重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組木聚糖酶的表達；以及3）發酵結束後，回收並純化所表達的木聚糖酶V-XYL。
其中，整個發酵過程可分為3個階段：第一階段為菌體培養階段，按5％-10％比例接入種子，培養24-30小時，以補完甘油為標誌；第二階段為飢餓階段，當甘油補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80％以上即表明該階段結束，為期約30-60分鐘；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20％以上，培養時間在150-180小時之間。發酵結束後，發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得粗酶液。利用《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的方法高效表達上述的重組木聚糖酶，可達到100000每毫升的發酵水平。《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》還提供了上述木聚糖酶V-XYL在飼料添加劑、石油化工、釀酒等工業中的套用。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》是從自然環境中篩選、分離得到能夠適用於飼料工業化生產的木聚糖酶。《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的木聚糖酶V-XYL最適pH值為5.0，pH在3.0～7.0的條件下處理4個小時，酶活性維持在85％以上，說明其具有良好的pH穩定性；而且具有良好的抗蛋白酶降解的能力，可套用於飼料添加劑中，抵抗動物腸胃中蛋白酶的降解，同時有效降低胃腸道食糜的粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗營養作用，促進動物對於飼料的利用率。另外，該木聚糖酶製成酶製劑，在室溫保存12個月後，酶活性維持在90％以上，具有好的穩定性，因此，《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》的木聚糖酶可在飼料、石油化工、釀酒等工業中顯示出其巨大的套用潛力。
附圖說明
圖1重組木聚糖酶V-XYL的最適反應pH。
圖2重組木聚糖酶V-XYL的pH穩定性。
圖3重組木聚糖酶V-XYL的最適反應溫度。
圖4重組木聚糖酶V-XYL的熱穩定性。
圖5重組木聚糖酶V-XYL的抗蛋白酶降解能力。
圖6重組木聚糖酶V-XYL固體酶粉在室溫條件下貯存的穩定性。
圖7重組木聚糖酶V-XYL抗胃腸中蛋白酶降解能力的測定。
圖8重組木聚糖酶V-XYL在室溫條件下的貯存穩定性能的測定。
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》從自然環境中篩選到一種天然菌株，大腸埃希氏菌EC080510（Escherichiacoli），該菌株於2010年10月20日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏中心地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），其保藏編號是：CGMCCNo.4234。
技術領域
《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》涉及基因工程領域，具體地，《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》涉及一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用。
權利要求
1.一種產木聚糖酶的大腸桿菌Escherichiacoli，其保藏號為：CGMCCNo.4234。
2.一種木聚糖酶，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.一種木聚糖酶基因，其特徵在於，編碼權利要求2所述的木聚糖酶。
4.如權利要求3所述的木聚糖酶基因，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.2所示。
5.包含權利要求3或4所述木聚糖酶基因的重組載體。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於，將胺基酸序列如SEQIDNO.1所示的木聚糖酶的編碼基因插入到質粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-V-XYL。
7.包含權利要求3或4所述木聚糖酶基因的重組菌株。
8.一種高效表達木聚糖酶的方法，其特徵在於，包括以下步驟：1）用權利要求6所述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；2）重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組木聚糖酶的表達；以及3）發酵結束後，回收並純化所表達的木聚糖酶V-XYL。
9.權利要求2所述的木聚糖酶降解木聚糖的套用。
實施方式
操作內容
以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實驗材料和試劑：
1、菌株與載體
大腸桿菌菌株Top10、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自Invitrogen公司。
2、酶與試劑盒
基因組DNA提取試劑盒，質粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。基因文庫構建試劑盒LamdaZapII購自Stratagene公司。限制性內切酶購自Fermentas公司。
3、反應底物
Azo-xylan購自Megazyme公司。
實施案例
- 實施例1 產木聚糖酶大腸桿菌Escherichiacoli的分離、培養
將來源於內蒙古某養牛場的牛瘤胃內容物經富集培養後（富集培養基：（NH4）2SO45克/升，KH2PO41克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，CaCl20.2克/升，玉米芯粉0.5％，麩皮0.5％，pH4），按常規稀釋後塗布於產酶培養基（（NH4）2SO45克/升，KH2PO41克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，CaCl20.2克/升，木聚糖1％，瓊脂糖1.5％，pH4）平板上，30℃培養5～6d，挑取產生透明圈菌落在產酶培養基平板劃線分離，經過3輪重複劃線分離，使菌株純化。通過此方法篩選到表達木聚糖酶的菌株，經鑑定為大腸桿菌Escherichiacoli，該菌株的保藏編號為：CGMCCNo.4234。
- 實施例2 大腸桿菌Escherichiacoli木聚糖酶基因V-XYL的克隆
木聚糖酶基因V-XYL的克隆採用構建基因組文庫的方法，首先提取大腸桿菌Escherichiacoli的基因組，按照基因文庫構建試劑盒LamdaZapII的說明書構建大腸桿菌的基因組文庫。
具體方法是，培養篩選獲得的產木聚糖酶大腸桿菌菌株，提取其基因組DNA。獲得的大腸桿菌基因組DNA和噬菌體載體LambdaZapII通過限制性內切酶EcoRI酶切後，過夜連線。經過體外包裝，轉染大腸桿菌受體菌XL1-BlueMRF’後鋪平板，37度過夜培養。
鑑定構建得到基因文庫滴度確保每個平板上獲得密集的相對獨立的噬菌斑。用含1％azo-xylan，1.5％瓊脂糖的產酶培養基平板平鋪到噬菌斑平板上層。37度培養，4小時及過夜培養後觀察透明圈。
挑取產生透明圈最大的噬菌體，按照單噬菌斑Excision方法獲得含有木聚糖酶基因的質粒pBluesciptSK，提取質粒DNA進行序列測定。
測序結果表明獲得克隆DNA插入片段含有木聚糖酶基因完整的開放閱讀框。該木聚糖酶基因V-XYL，全長717bp，編碼237個胺基酸，其胺基酸序列通過BLAST比對，與來源於產琥珀酸絲狀桿菌Fibrobacter succinogenes及單中心真菌Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶具有較高的一致性，最高一致性為76％，表明該蛋白為一種新型木聚糖酶。
- 實施例3 包含木聚糖酶基因V-XYL的畢赤酵母工程菌的構建
根據基因序列設計帶有EcoRI和NotI酶切位點的引物VXYL-eco和VXYL-not，將木聚糖酶基因V-XYL插入到質粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-V-XYL。
VXYL-eco：5’AGCTGAATTCATGGTAAGTCGACATCT3’
VXYL-not：5’TGGTGCGGCCGCCTAAGAAGTTTTAATCCTTCT3’
重組酵母表達質粒pPICzαA-V-XYL用SacI進行線性化，線性化後的重組載體電擊轉化畢赤酵母X33，得到畢赤酵母重組菌株X33/V-XYL。
將上述重組菌株接種於BMGY培養液中，30℃250轉每分振盪培養48小時後，離心收集菌體。然後於150毫升BMMY培養基重懸，30℃250轉每分振盪培養。誘導表達72小時後，每天添加0.5％的甲醇，離心收集上清，同時，按木聚糖酶檢測方法測定上清液中木聚糖酶的活力。
通過檢測各菌株在搖瓶中的發酵酶活，測定產酶性能菌株的搖瓶水平木聚糖酶的表達量達到666每毫升。
採用GE蛋白純化系統（型號：AKTAPRIMEPLUS）對酶液進行純化，獲得高純度木聚糖酶，經檢測，該木聚糖酶的比活為8345U/mg。
- 實施例4 木聚糖酶重組菌株的高效表達
在發酵罐上進行上述木聚糖酶重組菌株的發酵，發酵使用的培養基為BSM培養基。
BSM培養基配方如下：磷酸26.7毫升/升、硫酸鉀18.2克/升、硫酸鎂14.9克/升、氫氧化鉀4.13克/升、甘油40克/升、微量元素（PTM1）4.4毫升/升、消泡劑少量。
PTM1（微量鹽溶液）：硫酸銅0.6％、碘化鉀0.018％、一水硫酸錳0.3％、二水鉬酸鈉0.02％、硼酸0.002％、六水氯化鈷0.05％、氯化鋅2％、七水硫酸鐵6.5％、濃硫酸0.5％、生物素0.02％。
發酵生產工藝：pH值4.80、溫度30℃、攪拌速率100-500轉每分、通風量1.0-1.8（V/V）、溶氧DO控制在20％以上。
整個發酵過程可分為3個階段：第一階段為菌體培養階段，按5％-10％比例接入種子，培養24-30小時，以補完甘油為標誌；第二階段為飢餓階段，當甘油補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80％以上即表明該階段結束，為期約30-60分鐘；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20％以上，培養時間在150-180小時之間。發酵結束後，發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得粗酶液。
通過測定不同時間發酵液中的木聚糖酶活力及菌體量，可得發酵進程曲線，見圖1和圖2。
由發酵結果可以看出，重組菌株最終的發酵能力最高可達到117293U/毫升，大大高於目前的報導水平。
- 實施例5 重組木聚糖酶的活性分析
1、酶活單位的定義
在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為5毫克/毫升的木聚糖溶液中釋放1微摩爾還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位。
2、測定方法
吸取經適當的木聚糖底物，37℃平衡10分鐘，加入到比色管中，再加入經37℃平衡的等量的純化的重組木聚糖酶液，混勻，於37℃精確保溫反應30分鐘。反應結束後，加入適量的DNS試劑，混勻以終止酶解反應。然後沸水浴加熱5分鐘，用自來水冷卻至室溫，加水定容至規定體積，混勻後以標準空白樣為空白對照，在540納米處測定吸光值AE。
酶活計算公式：
式中：X為試樣稀釋液中木聚糖酶活力，每毫升；AE為酶反應液中的吸光度；AB為酶空白樣的吸光度；K為標準曲線的斜率；Co為標準曲線的截距；M為木糖的摩爾質量（150.2克/摩爾）；T為酶解反應時間，分鐘；N為試樣的稀釋倍數；1000為轉化因子，1毫摩爾＝1000微摩爾
- 實施例6 重組木聚糖酶V-XYL的性質測定
1、重組木聚糖酶V-XYL的最適pH和pH穩定性的測定
將純化的重組木聚糖酶V-XYL在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物木聚糖用不同pH的緩衝液配置，在37℃下進行木聚糖酶活力測定。結果為如圖3所示，表明重組酶V-XYL的最適pH為5.0。
將純化的重組木聚糖酶V-XYL於上述各種不同pH的緩衝液中37℃處理4小時，再在pH5.0緩衝液體系37℃下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果如圖4所示，表明木聚糖酶在pH3.0-7.0之間均很穩定，在此pH範圍內處理4h後剩餘酶活性在85％以上，這說明此酶在酸性範圍內具有較好的pH穩定性。
2、重組木聚糖酶V-XYL的最適溫度及熱穩定性的測定
木聚糖酶的最適溫度的測定為在pH5.0緩衝液體系及不同溫度下進行酶促反應。結果如圖5所示，表明其最適溫度為60℃。
熱穩定性測定為將純化的重組木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在37℃下進行酶活性測定。結果如圖6所示，表明木聚糖酶V-XYL在60℃溫度下具有很好的穩定性，處理1小時後還有60％以上的相對活性，在70℃下溫育10分鐘，能保持50％以上的相對活性。
3、不同金屬離子化學試劑對重組木聚糖酶V-XYL酶活影響的測定
在酶促反應體系中加入不同濃度的不同金屬離子及化學試劑，研究其對重組木聚糖酶酶活性的影響，各種物質終濃度為1毫摩爾/L。在37℃、pH5.0條件下測定酶活性。結果如下表所示。
1毫摩爾每升金屬離子 | 相對酶活(％) |
Cu | 71.48 |
Fe | 85.20 |
Fe | 91.60 |
EDTA | 95.37 |
Ca | 99.67 |
Hg | - |
Mg | 128.87 |
Na | 72.97 |
Li | 84.60 |
Ag | - |
Co | 107 |
Zn | 86.45 |
表明，在離子和化學試劑的濃度為1毫摩爾時，Mg可以明顯促進重組木聚糖酶的活性，Cu、Fe、Na、Li、Zn對重組木聚糖酶的活性有輕微的抑制作用，其他離子和化學試劑對重組木聚糖酶的活力沒有明顯的影響。
4、重組木聚糖酶V-XYL抗胃腸中蛋白酶降解能力的測定
將純化後的重組木聚糖酶V-XYL在人工胃液和人工腸液中處理不同時間（人工胃液組成：NaCl2克、胃蛋白酶3.2克、36.5％濃鹽酸7毫升、加水至1000毫升，pH1.3；人工腸液組成：磷酸二氫鉀0.029摩爾每升、KCl0.02摩爾每升、牛磺膽酸鈉5毫摩爾每升、磷酯酸膽鹼1.5毫摩爾每升、pH6.8），然後取處理後的酶液在pH5.0及37℃條件下測定酶活性。實驗結果如圖7所示，表明木聚糖酶V-XYL用人工胃液和人工腸液中處理90分鐘後，還有80％以上的相對活性，說明其具有良好的抗蛋白酶降解的能力。
5、固體酶製劑在室溫條件下的貯存穩定性能的測定
重組木聚糖酶V-XYL經工業化的加工製成固體酶製劑，在室溫條件下貯存12個月，每個月取一次樣品測定酶活性，測定結果如圖8所示，結果表明該木聚糖酶在室溫條件下貯存12個月，酶活力基本上沒有損失，還有90％以上的剩餘活力，說明其具有良好的穩定性。
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種木聚糖酶及其基因、高效表達的方法和套用》獲得第二十屆中國專利獎優秀獎。
