《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》是中國農業科學院飼料研究所於2008年5月28日申請的專利，該專利的申請號為2008101133429，公布號為CN101457206，授權公布日為2009年6月17日，發明人是姚斌、羅會穎、楊培龍、王亞茹、柏映國、孟昆、袁鐵錚、石鵬君、史秀雲。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》涉及基因工程領域，具體地，該發明涉及一種產酸性木聚糖酶的菌株Bispora sp.MEY－1，和從該菌種中得到的酸性木聚糖酶XYL10A，其具有如SEQ IDNO.1或2所示的胺基酸序列，編碼上述木聚糖酶的基因，其具有如SEQI DNO.1或2所示的核苷酸序列，以及包含該基因的重組載體、重組菌株和重組酶的套用。該發明的木聚糖酶的具有以下性質：最適pH2.4，最適溫度80℃，良好的pH穩定性和熱穩定性；比活5437U/毫克；極好的蛋白酶抗性以及易於工業化發酵生產。做為一種新型的酶製劑，可廣泛用於動物飼料、食品、醫藥、釀酒、能源工業等。
2016年12月7日，《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用
- 公布號：CN101457206
- 授權日：2009年6月17日
- 申請號：2008101133429
- 申請日：2008年5月28日
- 申請人：中國農業科學院飼料研究所
- 地址：北京市海淀區中關村南大街12號
- 發明人：姚斌、羅會穎、楊培龍、王亞茹、柏映國、孟昆、袁鐵錚、石鵬君、史秀雲
- Int.Cl.：C12N1/14(2006.01)I、C12N9/42(2006.01)I、C12N15/56(2006.01)I、C12N15/63(2006.01)I、C12N15/81(2006.01)I等
- 代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
- 代理人：楊小蓉
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,實例說明,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
木聚糖是半纖維素的重要組分，它是自然界中含量僅次於纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機碳含量的三分之一（Prade.Biotech.andGenticEngi.Rev..13（12）：101～131，1995）。廣泛存在於在農業副產物如玉米芯、麥麩、米糠、秸稈、甘蔗渣等中，但這一重要的可再生資源一直難以得到有效的利用。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱，對木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在適合於食品工業、製漿造紙工業、能源工業等方面的木聚糖酶，已經從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。並分離出多種木聚糖酶基因，已工業化生產多種木聚糖酶產品。
但人們對嗜酸性木聚糖酶的研究遠不及鹼性木聚糖酶（Collinsetal.FEMSMicrobiolRev，29（1）：3-23，2005），有關酸性木聚糖酶的報導比較少，大多數木聚糖酶的最適作用pH值在6～7。酸性木聚糖酶（pH4.0以下時仍然保持較高酶活性）已經引起研究人員的廣泛關注，酸性木聚糖酶的產生、純化、性質、酸性特徵的結構基礎及其在飼料加工、釀酒工業、果汁加工、以及能源等領域的套用正在不斷深入。
在嗜酸木聚糖酶中研究較多的有來源於Aspergillus sp.（Johanetal.Current Genetics.28（5）：467～473，1995），Penicillium sp.（Kimura et al.BiosciBiotechnol Biochem64：1230～1237，2000），Acidobacterium sp.（Inagaki etal.Biosci.Biotechnol.Biochem.62：1061～1067，1998），Cryptococcussp.（Iefujietal.BiosciBiotechnolBiochem60：1331～1338，1996）和Scytalidium acidophilum（AlBalaa et al.BiosciBiotechnol Biochem.70（1）：269～272，2006）的酸性木聚糖酶。它們基因已經被克隆，並且已經大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等表達系統中進行了表達，但仍沒有工業化生產嗜酸木聚糖酶。在中國，對嗜酸木聚糖酶的研究很少，僅克隆了少數酸性木聚糖酶基因，運用基因工程手段來產業化生產嗜酸木聚糖酶產品還未見報導。
發明內容
專利目的
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的目的在於提供一種產酸性木聚糖酶的菌株Bisporasp.MEY-1。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供來源於上述菌株的酸性木聚糖酶。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供包含上述木聚糖酶的重組載體。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重組菌株。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供一種製備酸性木聚糖酶的方法。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的再一目的是提供上述酸性木聚糖酶的套用。
技術方案
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》首先所要解決的技術問題是克服2008年5月之前技術的不足，提供一種性質優良的、適合於在飼料、食品、釀酒以及能源工業中套用新的木聚糖酶。《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》人篩選到一種天然菌株，它所產生的木聚糖酶適合於在飼料、食品、釀酒以及能源工業中使用。該嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1，於2008年5月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101），其保藏號為：CGMCCNo.2500。
從上述菌株中獲得了一種酸性木聚糖酶XYL10A，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1 所示 ：
MSFHSLLISG | LLASVAVAVP | KEAWGITVTE | TKTVSTTIIA | TVTELGTCSS |
TITSPTSDAT | 60 | |||
TTTTSSATNT | NPTTTLLATP | QPSNWGLNNA | ARADGKLWFG | TAADIPGLEQ |
DDRYYMKEYN | 120 | |||
NTHDFGGTTP | ANIMKFMFTE | PEQNVFNFTG | AQEFLDIAFA | SHKLVRCHNL |
IWQSELPTWV | 180 | |||
TNPTTNWTNE | TLSKVLQNHV | YTLVSHFGDQ | CYSWDVVNEA | LSDDPAGSYQ |
NNIWFDTIGP | 240 | |||
EYVAMAFEYA | EKAVKDHKLN | VKLYYNDYNI | EYPGPKSTAA | QNIVKELKAR |
NIQIDGVGLE | 300 | |||
SHFIAGETPS | QATQITNMAD | FTSLDIDVAV | TELDVRLYLP | PNATSEAQQV |
ADYYATVAAC | 360 | |||
AATERCIGIT | VWDFDDTYSW | VPSTFAGQGY | ADLFFQPDGP | NTPLVKKAAY |
DGCLQALQHK | 420 | |||
AESP | 424 |
其中，該酶基因編碼424個胺基酸，N端18個胺基酸為其預測的信號肽序列“MSFHSLLISG LLASVAVA”。
因此，成熟的酸性木聚糖酶XYL10A的理論分子量為45.8千道爾頓，其胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
VPKEAWGITV | TETKTVSTTI | IATVTELGTC | SSTITSPTSD | ATTTTTSSAT |
NTNPTTTLLA | 60 | |||
TPQPSNWGLN | NAARADGKLW | FGTAADIPGL | EQDDRYYMKE | YNNTHDFGGT |
TPANIMKFMF | 120 | |||
TEPEQNVFNF | TGAQEFLDIA | FASHKLVRCH | NLIWQSELPT | WVTNPTTNWT |
NETLSKVLQN | 180 | |||
HVYTLVSHFG | DQCYSWDVVN | EALSDDPAGS | YQNNIWFDTI | GPEYVAMAFE |
YAEKAVKDHK | 240 | |||
LNVKLYYNDY | NIEYPGPKST | AAQNIVKELK | ARNIQIDGVG | LESHFIAGET |
PSQATQITNM | 300 | |||
ADFTSLDIDV | AVTELDVRLY | LPPNATSEAQ | QVADYYATVA | ACAATERCIG |
ITVWDFDDTY | 360 | |||
SWVPSTFAGQ | GYADLFFQPD | GPNTPLVKKA | AYDGCLQALQ | HKAESP |
406。 |
該木聚糖酶XYL10A同時具有好的熱穩定性而在常溫下又必須具備高活性、在酸性和中性的範圍內均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》篩選到的嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1所產生的木聚糖酶，其最適pH值為2.4，在pH2～5的範圍內維持50％以上的酶活性；最適溫度為80℃，在80℃下處理10分鐘，酶活性維持在70％以上；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理60分鐘，酶活性維持在130-150％。這種性質的木聚糖酶還未曾有過報導。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》還提供了編碼上述酸性木聚糖酶XYL10A的基因xyl10A。
該酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：
atgtctttcc | actcgcttct | aatctcaggt | cttctggcat | ctgtggctgt | ggctgtcccc | 60 |
aaagaagctt | ggggaattac | agtgacggag | acaaaaacgg | tctccacaac | aatcatcgca | 120 |
acagtcaccg | aattgggcac | ttgctcttcc | acaattactt | cacctaccag | tgatgctacc | 180 |
acgacgacca | cgtctagtgc | aaccaacact | aatcctacca | cgacacttct | tgccacgccg | 240 |
cagccttcca | attggggtct | taataatgca | gctcgagccg | atggcaagct | ttggtttgga | 300 |
actgctgcag | atatccccgg | tttagagcag | gatgatcgct | attacatgaa | ggaatacaac | 360 |
aatacgcatg | attttggtgg | taccacaccc | gcgaatatta | tgaaattcat | gttcacggag | 420 |
ccagagcaaa | acgtttttaa | tttcaccggc | gcgcaggagt | tcctggacat | tgcctttgcg | 480 |
tcgcacaagc | ttgttcgttg | ccacaatctt | atctggcaat | ccgagcttcc | cacatgggtt | 540 |
actaacccta | ccacaaattg | gacaaacgaa | accttgagca | aggtgctaca | aaatcatgta | 600 |
tatactctag | tctcacattt | tggagatcag | tgctatagct | gggatgtggt | taacgaagcc | 660 |
ctctctgatg | acccagccgg | atcgtatcaa | aacaatatct | ggttcgacac | tattggtccc | 720 |
gagtacgttg | cgatggcatt | cgagtatgcc | gagaaagccg | tcaaagacca | taagttgaat | 780 |
gttaagctct | actacaatga | ctacaacatt | gaatatcctg | ggcccaaatc | tacagcagca | 840 |
cagaatattg | tcaaggagct | taaagcaagg | aacatccaaa | tagatggcgt | cggccttgag | 900 |
tcccacttca | tcggtaagtc | ctaaagcttc | tgagggaatc | ctatgttcac | aacttgatgc | 960 |
ttacccttcc | ctagctggtg | aaactccgtc | tcaggctacg | caaatcacaa | acatggctga | 1020 |
tttcacttct | cttgacattg | acgttgctgt | taccgagctc | gatgtacgtc | tttatctgcc | 1080 |
tccaaatgct | accagcgagg | cccagcaagt | tgccgactat | tacgccaccg | tcgcagcctg | 1140 |
tgctgcaaca | gaacgctgta | tcggtataac | tgtctgggat | tttgacgata | catattcatg | 1200 |
ggtgcccagc | acgttcgccg | gccaagggta | tgcggatctg | ttcttccagc | cagacggccc | 1260 |
caacactccc | ctagtgaaaa | aagcggcgta | cgacggttgc | ctacaggctt | tgcaacataa | 1320 |
ggcggaaagt | ccatga | 1336 |
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因xyl10A，DNA全序列分析結果表明，木聚糖酶XYL10A結構基因xyl10A全長1336bp，含有一個內含子，cDNA長1275bp，+914～+974bp為61bp的內含子序列，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。
gtccccaaag | aagcttgggg | aattacagtg | acggagacaa | aaacggtctc | cacaacaatc | 60 |
atcgcaacag | tcaccgaatt | gggcacttgc | tcttccacaa | ttacttcacc | taccagtgat | 120 |
gctaccacga | cgaccacgtc | tagtgcaacc | aacactaatc | ctaccacgac | acttcttgcc | 180 |
acgccgcagc | cttccaattg | gggtcttaat | aatgcagctc | gagccgatgg | caagctttgg | 240 |
tttggaactg | ctgcagatat | ccccggttta | gagcaggatg | atcgctatta | catgaaggaa | 300 |
tacaacaata | cgcatgattt | tggtggtacc | acacccgcga | atattatgaa | attcatgttc | 360 |
acggagccag | agcaaaacgt | ttttaatttc | accggcgcgc | aggagttcct | ggacattgcc | 420 |
tttgcgtcgc | acaagcttgt | tcgttgccac | aatcttatct | ggcaatccga | gcttcccaca | 480 |
tgggttacta | accctaccac | aaattggaca | aacgaaacct | tgagcaaggt | gctacaaaat | 540 |
catgtatata | ctctagtctc | acattttgga | gatcagtgct | atagctggga | tgtggttaac | 600 |
gaagccctct | ctgatgaccc | agccggatcg | tatcaaaaca | atatctggtt | cgacactatt | 660 |
ggtcccgagt | acgttgcgat | ggcattcgag | tatgccgaga | aagccgtcaa | agaccataag | 720 |
ttgaatgtta | agctctacta | caatgactac | aacattgaat | atcctgggcc | caaatctaca | 780 |
gcagcacaga | atattgtcaa | ggagcttaaa | gcaaggaaca | tccaaataga | tggcgtcggc | 840 |
cttgagtccc | acttcatcgc | tggtgaaact | ccgtctcagg | ctacgcaaat | cacaaacatg | 900 |
gctgatttca | cttctcttga | cattgacgtt | gctgttaccg | agctcgatgt | acgtctttat | 960 |
ctgcctccaa | atgctaccag | cgaggcccag | caagttgccg | actattacgc | caccgtcgca | 1020 |
gcctgtgctg | caacagaacg | ctgtatcggt | ataactgtct | gggattttga | cgatacatat | 1080 |
tcatgggtgc | ccagcacgtt | cgccggccaa | gggtatgcgg | atctgttctt | ccagccagac | 1140 |
ggccccaaca | ctcccctagt | gaaaaaagcg | gcgtacgacg | gttgcctaca | ggctttgcaa | 1200 |
cataaggcgg | aaagtccatg | a | 1221 |
其中，信號肽的鹼基序列為：ATGTCTTTCC ACTCGCTTCT AATCTCAGGTCTTCTGGCAT CTGTGGCTGT GGCT。
成熟蛋白理論分子量為45.8千道爾頓。將木聚糖酶基因xyl10AcDNA序列及推導出的胺基酸序列在GenBank中進行BLAST比對。發現與信號肽相連的是一段富含絲氨酸和蘇氨酸的區域（19～57個胺基酸），比對中沒有發現與該區蛋白質序列一致的序列，去除該段序列後與來源於Penicilliumfuniculosum的木聚糖酶D核苷酸序列一致性為57.1％，胺基酸序列一致性為45.7％。為此基因的改造並在各種外源基因表達系統中高效表達提供優良的基因材料。說明XYL10A是一種新的木聚糖酶。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組載體，優選為pPIC9-xyl10A。將《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連線。作為《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的一個最優選的實施方案，優選為將木聚糖酶基因插入到質粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核 苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPIC9-xyl10A。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組菌株，優選為重組菌株GS115/xyl10A。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》還提供了一種製備酸性木聚糖酶的方法，包括以下步驟：1）用權利要求重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2）培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶的表達；以及3）回收並純化所表達的木聚糖酶。
其中，優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞（Pichicpastoris）GS115，得到重組菌株GS115/xyl10A。
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》還提供了上述酸性木聚糖酶的套用。
改善效果
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的木聚糖酶最適pH為2.4，在pH2.0～6.0都有較高的酶活性；熱穩定性好，能夠滿足普通飼料制粒工藝；具有極好的抗蛋白酶的能力。符合動物消化生理特點、pH適應範圍提高飼料消化能和代謝能，降低配方成本，減少環境污染；提高穀物加工副產品的營養價值，提升飼料產品品質。本木聚糖酶可套用於釀酒工業，降低物料粘度，可以有利於澱粉酶作用於澱粉層，提高澱粉利用率，增加酒精的產率。還可以將造紙工業廢料及農業廢棄物中的木聚糖可被轉化為D-木糖單體，而D-木糖又可被細菌、酵母及真菌轉化成有價值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工業中的套用也顯示出其巨大的潛力。水解產物（木糖和低聚木糖）可套用在食品行業，作為增稠劑、脂肪代替物和抗凍食品添加劑；在製藥工業中木聚糖與其它物質結合使用，可以延緩藥物成分的釋放。木聚糖的水解產物還可以進一步轉化為液體燃料、單細胞蛋白、溶劑和低熱量甜味劑。
附圖說明
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》的發明人分離得到嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1，於2008年5月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101），其保藏號為：CGMCCNo.2500。
圖1xyl10A在畢赤酵母中表達的木聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量標準；2，發酵培養上清；3，純化的重組木聚糖酶。
圖2《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》重組木聚糖酶的最適pH值。
圖3《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》木聚糖酶的pH穩定性。
圖4《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》木聚糖酶最適反應溫度。
圖5《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》木聚糖酶熱穩定性。
圖6蛋白酶處理《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》木聚糖酶後的酶活曲線（A）和SDS—PAGE分析（B），1、分子量標準；2、木聚糖酶XYL10A；3、胰蛋白酶處理後的XYL10A；4、胰蛋白酶；5和6、胃蛋白酶處理後的XYL10A；7、胃蛋白酶。
技術領域
《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》涉及基因工程領域，具體地，《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》涉及一種產酸性木聚糖酶的菌株Bisporasp.MEY-1，和從該菌種中得到的酸性木聚糖酶XYL10A及其基因、包含該基因的重組載體和套用。
權利要求
1、一種嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1，其保藏號為：CGMCCNo.2500。
2、一種酸性木聚糖酶XYL10A，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3、一種酸性木聚糖酶XYL10A，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.2所示。
4、一種酸性木聚糖酶基因xyl10A，其特徵在於，編碼權利要求2或3所述的木聚糖酶。
5、如權利要求4所述的木聚糖酶基因xyl10A，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.3所示。
6、如權利要求4所述的木聚糖酶基因xyl10A，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.4所示。
7、包含權利要求4、5或6所述木聚糖酶基因的重組載體。
8、包含權利要求4、5或6所述木聚糖酶基因的重組載體pPIC9-xyl10A。
9、包含權利要求4、5或6所述木聚糖酶基因的重組菌株。
10、一種製備酸性木聚糖酶XYL10A的方法，其特徵在於，包括以下步驟：1）用權利要求7重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2）培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶的表達；以及3）回收並純化所表達的木聚糖酶XYL10A。
11、如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞。
12、權利要求2或3所述的酸性木聚糖酶XYL10A的套用。
實施方式
實例說明
1、菌株及載體：Bisporasp.MEY-1由《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》人分離獲得，畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自於Invitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑：內切酶購自TaKaRa公司，連線酶購自Invitrogen公司。燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。
3、培養基：
（1）Bisporasp.MEY-1培養基為馬鈴薯汁培養基：1000毫升馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH2.5。
（2）大腸桿菌培養基LB（1％蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0）。
（3）BMGY培養基：1％酵母提取物，2％蛋白腖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油（V/V）。
（4）BMMY培養基：除以0.5％甲醇代替甘油，其餘成份均與BMGY相同，pH4.0。
說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施案例
實施例1 分離嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1
將來源於江西某礦的鈾礦廢水樣品經富集培養後（富集培養基：（NH4）2SO45克/升，KH2PO41克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，CaCl20.2克/升，玉米芯粉0.5％，麩皮0.5％，pH2.5），按常規稀釋後塗布於產酶培養基（（NH4）2SO45克/升，KH2PO41克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，CaCl20.2克/升，木聚糖1％，1.5％瓊脂糖，pH2.5）平板上，30℃培養5～6d，挑取產生透明圈菌落在產酶培養基平板劃線分離，重複劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到該分泌木聚糖酶的菌株。
本菌株在PDA上30℃下培養7d菌落直徑2～3厘米，灰黑色或灰褐色，呈圓形放射狀，表面有絨狀皺褶且不易於挑起。分生孢子梗直立，（6～9）微米×（10～13）微米。頂端產生鏈生孢子，分生孢子有隔，0～1隔，橢圓形至紡錘形，無分枝，棕色至深棕色，（5～8.25）微米×（10～19）微米。其最適生長pH為2.5～3.0，最適溫度30℃。該嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1，於2008年5月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101），其保藏號為：CGMCCNo.2500。
實施例2 嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1木聚糖酶編碼基因xyl10A的克隆
提取嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1基因組DNA：
將液體培養3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2毫升提取液，研磨5分鐘，然後將研磨液置於50毫升離心管中，65℃水浴鍋裂解20分鐘，每隔10分鐘混勻一次，在4℃下10000轉每分離心5分鐘。取上清於酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，於室溫靜置5分鐘後，4℃下10000轉每分離心10分鐘。棄上清，沉澱用70％的乙醇洗滌兩次，真空乾燥，加入適量TE溶解，置於-20℃備用。
根據第十家族木聚糖酶基因的保守（WDVVNEA和NDY（F）NL（I）EY）序列設計合成了簡併引物P1，P2
P1：5′-TGGGA（C/T）GT（A/G/C/T）GT（A/G/C/T）AA（C/T）GA（A/G）GC-3′；
P2：5′-TA（C/T）TCTAT（A/G）TT（A/G）WA（A/G）TC（A/G）TT-3′）。
以嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為：94℃變性3分鐘；然後94℃變性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1分鐘，32個循環後72℃保溫10分鐘。得到一約180bp片段，將該片段回收後與pEASY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。
根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物：設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在sp1的內側，sp3位於sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22～30nt，退火溫度在60～65℃。並將它們分別命名為usp1，usp2，usp3（上游特異性引物），dsp1，dsp2，dsp3（下游特異性引物）見表1。
表1.木聚糖酶XYL10ATAIL-PCR特異性引物
通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收後送三博生物技術有限公司測序。
實施例3 木聚糖酶基因的RT-PCR分析
提取Bisporasp.MEY-1的總RNA，利用反轉錄酶得到cDNA的一條鏈，然後設計恰當的引物（Xyl10AF：5′-ATGTCTTTCCACTCGCTTCTAATCTCAGGTCTTC-3′，Xyl10AR：5′-TCATGGACTTTCCGCCTTATGTTGCAAAGCC-3′）擴增該單鏈cDNA，獲得木聚糖酶的cDNA序列，擴增得到產物回收後送三博生物技術有限公司測序。
通過比較木聚糖酶的基因組序列和cDNA序列後發現該基因有1個內含子，cDNA長1275bp，編碼424個胺基酸和一個終止密碼子，N端18個胺基酸為其預測的信號肽序列。所測出的基因xyl10A的成熟蛋白部分核甘酸序列與GeneBank上的木聚糖酶基因序列進行同源比較，最高一致性為57.1％，胺基酸序列最高一致性為45.7％，證明從Bisporasp.MEY-1中分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基因為新基因。
實施例4 重組木聚糖酶的製備
將表達載體pPIC9進行雙酶切（EcoRI+NotI），同時將編碼木聚糖酶的基因xyl10A雙酶切（EcoRI+NotI），切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連線，獲得含有Bisporasp.MEY-1木聚糖酶基因xyl10A的重組質粒pPIC-xyl10A並轉化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/xyl10A。
取含有重組質粒的GS115菌株，接種於400毫升BMGY培養液中，30℃250轉每分振盪培養48小時後，離心收集菌體。然後於200毫升BMMY培養基重懸，30℃250轉每分振盪培養。誘導48小時後，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達量為101U/毫升。SDS-PAGE結果（圖1）表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到 了表達。所表達的木聚糖酶經過純化之後，其蛋白質的含量達到總蛋白的90％以上（圖4）。
實施例5 重組木聚糖酶的活性分析
DNS法：具體方法如下：在pH2.4，80℃條件下，1毫升的反應體系包括100微升適當的稀釋酶液，900微升底物，反應10分鐘，加入1.5毫升DNS終止反應，沸水煮5分鐘。冷卻後540納米測定OD值。1個酶活單位（U）定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1微摩爾還原糖的酶量。
實施例6 重組木聚糖酶XYL10A的性質測定
1、重組木聚糖酶XYL10A的最適pH和pH穩定性的測定方法如下：
將實施例4純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物木聚糖用不同pH的0.1摩爾/升檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液中80℃下進行木聚糖酶活力測定。結果（圖2）表明，XYL10A的最適pH為2.4，在pH2～5的範圍內，酶活性均維持在最大酶活性的50％以上。木聚糖酶於上述各種不同pH的緩衝液中37℃處理60分鐘，再在pH2.4緩衝液體系中80℃下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果（圖3）表明，木聚糖酶在pH1～7的範圍內穩定，說明此酶具有較好的耐酸性。
2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下：
木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液（pH2.4）緩衝液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在65℃下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果（圖4）表明，其最適溫度為80℃。酶的熱穩定性性試驗表明（圖5），80℃處理10分鐘後，剩餘酶活還有70％左右，處理20分鐘後，酶活性依然維持在55％以上。
3、木聚糖酶的Km值測定方法如下：
用不同濃度的木聚糖（4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，SigmaFrombirchwood）為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液（pH2.4）緩衝液體系中，80℃下測定酶活性，計算出其在80℃下的km值。經測定，此木聚糖酶在80℃下以木聚糖為底物的km值為1.005毫克/毫升，，最大反應速度Vmax為2709微摩爾/分鐘·毫克。
4、不同金屬離子化學試劑對XYL10A酶活的影響測定如下：
在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質終濃度為1，5和10毫摩爾/升。在80℃、pH2.4條件下測定酶活性。結果（表2）表明，低濃度的Cr、Ag和β-巰基乙醇對木聚糖酶XYL10A有明顯的激活作用。低濃度的Zn、Cu、Pb、Mn、Hg和SDS對酶活有一定的抑制作用。其餘金屬離子在低濃度時對XYL10A的酶促反應無顯著影響。高濃度的Cr和β-巰基乙醇對酶活有明顯的激活作用。高濃度的Ca、Mg、Co和Zn對酶活有一定的抑制作用。高濃度的Cu、Ni、Fe和Pb對酶活有很強的抑制作用，Hg和SDS可使酶完全失活。高濃度的其它離子對酶活影響不大。
表2.各種化學試劑對木聚糖酶XYL10A活力的影響
註：“-”代表無法檢測。
5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力測定如下：
用pH2.0KCl-HCl緩衝液配製0.1毫克/毫升胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl緩衝液配製0.1毫克/毫升胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl緩衝液稀釋後的0.5毫升純化的酶液加入0.5毫升胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl緩衝液稀釋後的0.5毫升純化的酶液加入0.5毫升胰蛋白酶混合，蛋白酶/木聚糖酶（w/w）≈0.1，37℃保溫0、2、5、8、10、20、30和60分鐘取樣，在pH2.4及80℃條件下測定酶活性。實驗結果表明木聚糖酶XYL10A用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理60分鐘後，木聚糖酶的活力均有所增加（圖6-A）。胃蛋白酶處理後的XYL10A的酶活比處理前提高了30％，胰蛋白酶處理後的XYL10A的 木聚糖酶活性比處理前提高了50％。胃蛋白酶和胰蛋白酶處理後的木聚糖酶XYL10A經SDS-PAGE分析表明：胰蛋白酶處理後的XYL10A的分子量略有降低。胃蛋白酶處理後的XYL10A的分子量基本沒有發生改變（圖6-B）。
6、木聚糖酶降解燕麥木聚糖產物的分析如下：
在500微升1％的木聚糖中加入100微升純化的酶液，最適溫度下保溫3～4小時。用無水乙醇將酶蛋白沉澱，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈衝安培（HPAEC-PAD）檢測方法，進行產物中糖種類的分析。分析結果表明：木聚糖酶XYL10A降解燕麥木聚糖的產物主要是木糖和木二糖。產物中木糖含量為72.23％，木二糖含量為27.77％。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種酸性木聚糖酶XYL10A及其基因和套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
