一種新的植酸酶的克隆和表達

《一種新的植酸酶的克隆和表達》是中國農業科學院飼料研究所於2006年4月30日申請的專利，該專利的公布號為CN101426907，申請公布日為2009年5月6日，發明人是姚斌、羅會穎、黃火清、王亞茹、袁鐵錚、史秀雲、柏映國、孟昆、楊培龍。

《一種新的植酸酶的克隆和表達》涉及具有以下性質的植酸酶：（a）理論分子量為45.5kDa，（b）高比活為3960±248U/毫克，（c）高溫下的良好熱穩定性和寬的pH作用範圍，（d）最適pH為4.0－5.0，（e）最適溫度50－60℃，（f）強的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。此植酸酶非常適合作為添加劑在單胃動物中使用。該發明也涉及含有所述基因的重組載體，含有所述重組載體的重組宿主細胞（例如，巴斯德畢赤酵母），以及使用所述重組宿主細胞生產植酸酶的方法。而且，該發明還涉及包含所述植酸酶和/或表達作為有效成分的植酸酶的宿主細胞的飼料添加劑。此外，該發明還提供了一種全新的從靶生物體中分離植酸酶基因的方法。

2015年11月27日，《一種新的植酸酶的克隆和表達》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。

（概述圖為《一種新的植酸酶的克隆和表達》摘要附圖）

基本介紹

• 中文名：一種新的植酸酶的克隆和表達
• 申請人：中國農業科學院飼料研究所
• 申請日：2006年4月30日
• 申請號：2006800543406
• 公布號：CN101426907
• 公布日：2009年5月6日
• 發明人：姚斌、羅會穎、黃火清、王亞茹、袁鐵錚、史秀雲、柏映國、孟昆、楊培龍
• 地址：中國北京市海淀區中關村南大街12號
• 分類號：C12N9/16(2006.01)I、C12N9/52(2006.01)I、C12N15/55(2006.01)I、C12N15/63(2006.01)I等
• 代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
• 代理人：楊小蓉
• 類別：發明專利

專利背景

植酸磷的含量占動物日糧中總磷50-70％。然而，單胃動物如雞和豬，缺乏從植酸分子水解釋放無機磷的消化酶，以致磷的利用率非常低。沒有被消化的植酸磷，通過消化道被排出體外。這導致對土地和水資源的增加的磷生態負擔。此外，由於植酸螯合幾個必要礦物質，抑制礦物質吸收。總之，在消化道中植酸降低食物的營養價值和飼料的利用率。

顯然，磷（P）是一個必要的生長元素，所以無機磷（如磷酸氫鈣，脫氟磷酸三鈣）或動物產品（如肉骨粉，魚粉）被添加到動物飼料中，以滿足動物對磷的營養需要。但是這些添加的成分都很昂貴。

植酸（肌醇六磷酸）是穀類食品或飼料中磷的主要儲存形式。植酸酶，是一類水解磷酸單脂鍵的磷酸酶，它能夠從植酸中水解釋放無機磷，植酸是P在穀物和飼料中的主要儲存形式（EGrafetal.1987）。植酸酶廣泛分布於植物、動物和微生物。基於不同來源的植酸酶的特徵的分析，微生物植酸酶正越來越多的受到關注。並且，微生物來源的植酸酶作為飼料添加劑，添加到典型的單胃動物日糧中，已經明顯的提高了植酸磷的營養利用率（Cromwell，etal，1993）。其結果是降低了動物飼料中無機磷的補充量，同時降低了排泄物中的磷的含量（Kornegay，etal，1996）。隨著基因工程技術的發展，一方面，越來越多的微生物菌植酸酶已被分離和/或純化。另一方面，通過定點突變或基因改組，常規植酸酶的性能改良也取得了一定進展。例如；“植酸酶phyA-m基因結構延伸突變改善酶的熱穩定性”（陳惠等，生物工程學報，2005年11月，21卷6期，983-987），或者“Site-directedmutagenesisofEscherichiacoliphytase”（USpatent6，841，370，LeiXG，2005）。這些取得的成果使得植酸酶的生產成本有了很大程度的降低。因為這些優勢，一些已知的植酸酶在飼料工業上得到廣泛套用。

但是，在這些已廣泛使用的植酸酶中，仍然存在著一些缺陷。因為這些植酸酶作為飼添加劑，並不能發揮它的理想作用。例如，大部分植酸酶在飼料制粒加工的過程中就已經高溫變性失活了，所以在腸道中不能發揮降解植酸的作用。其原因因酶不同而不同。主要是由於，這些酶的穩定性比較差（pH穩定性、熱穩定性、抗蛋白酶降解的穩定性以及在儲存運輸過程中的穩定性）和在胃腸道環境中活性比較低的緣故。

由於2006年前使用的植酸酶存在的這些缺陷，因此，人們希望能夠找到這樣一種新的植酸酶：其具有非常好的穩定性，在動物胃腸道中有非常高的活性，並且該植酸酶還能夠通過發酵技術大量生產，這樣可以使其成本大幅度的降低，從而能夠進一步推廣該植酸酶的使用。

另外，2006年4月之前的技術中分離植酸酶的手段有限，主要是通過構建基因組文庫，或直接從純化蛋白入手。但是，這兩種方式都比較耗費時間和勞力，效率非常的低，並且也非常昂貴。並且，在不同物種中植酸酶的相似性比較低，因此要獲得一段序列比較困難，這也是一個種對於利用2006年4月之前的方法去獲得一個新基因的挑戰。

發明內容

專利目的

為了解決2006年4月之前的技術中存在的缺陷，我們從中國一號冰川（新疆）的凍土中的數千種菌株中分離得到一株新型產植酸酶微生物。我們也確定了編碼具有植酸酶活性蛋白的核苷酸序列。在如畢赤酵母的表達宿主細胞中，植酸酶的表達量達到了一個較高水平。因此，重組畢赤酵母表達系統適合於工業化生產。並且這個新的植酸酶具有多種非常優良的特性，這些優良特性適合提高飼料的利用效率。

因此，一方面，《一種新的植酸酶的克隆和表達》提供了一種全新的生產植酸酶的中間耶爾森菌。該發明也提供了一種新的編碼具植酸酶活性的蛋白的新基因，其包含SEQID NO.2所示的核苷酸序列或其衍生序列。該發明還提供了具有如下性質的植酸酶，其理論分子量46kDa，最適pH在4-5之間，最適溫度在50-60℃之間，理論pI值為7.7，比活在3000U/毫克以上，且具有強的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。所述植酸酶可分離自耶爾森氏菌屬微生物，優選為中間型耶爾森氏菌。

因此該發明也涉及一種分離的蛋白，其選自：

（a）包含SEQIDNO.3所示胺基酸序列的多肽；

（b）由SEQIDNO.2所示的核酸分子或其簡併序列所編碼的多肽；

（c）由在嚴謹條件下與SEQIDNO.2所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸編碼且具有植酸酶活性的多肽；

（d）由SEQIDNO.2所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼且具有植酸酶活性的多肽；

（e）由SEQIDNO.3所示核酸分子所編碼被替換、刪除和/或插入一個或多個胺基酸殘基後具有植酸酶活性的多肽；

（f）與SEQIDNO.2所示的胺基酸序列具有至少60％，優選至少65％、70％、75％、80％、85％、或至少90％，更優選至少95％同源性且具有植酸酶活性的多肽。特別地，該發明還提供了一種簡單有效的從基因組DNA中克隆分離植酸酶的基因的方法，所述方法包括：

（a）基於植酸酶保守序列THGXRXP和HD設計一對簡併引物；

（b）利用所述引物通過PCR擴增部分植酸酶序列；

（c）進一步通過TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。

另外，該發明提供了包括所述編碼植酸酶的核酸的重組載體、已引入所述載體或所述核酸分子的重組宿主細胞（如畢赤酵母）、以及在宿主細胞中表達該酶的方法。進一步地，該發明還涉及所述植酸酶或者該植酸酶的生產菌株在製備飼料添加劑中的套用，以及含有作為有效組分的蛋白和/或宿主細胞的飼料添加劑。該發明的飼料添加劑因其含有促進植酸水解的植酸酶，從而可以有效地用於製備動物飼料。

保藏說明

由該專利發明人分離的中間型耶爾森氏菌（Yersiniaintermedi）H-27已於2006年4月25日保藏在位於中國北京市中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為：CGMCC1702。

序列簡述

SEQIDNo.1：中間型耶爾森氏菌（Yersiniaintermedia）H-27的16SrDNA序列；

SEQIDNo.2：新植酸酶的核酸序列；

SEQIDNo.3：新植酸酶的胺基酸序列；

SEQIDNo.4：克隆植酸酶基因的正向簡併引物序列；

SEQIDNo.5：克隆植酸酶基因的：反向簡併引物序列。

發明詳述

為了實現上述目標，首先，該發明提供了具有植酸酶活性的菌株。該菌株從中國一號冰川土樣（新疆）分離的。該菌株產生的植酸酶的活性通過硫酸亞鐵鉬藍法被測定。並且通過16srRNA序列分析鑑定了顯示植酸酶活性的菌株。結果，16SrDNA的基本序列顯示與Yersiniaintermedia99.5％的一致性，以及與Yersiniaaldovae和Yersiniamollaretii的序列的99％的一致性，所以可以確定該發明的菌株是一個新菌株。

該菌株為革蘭氏陰性桿菌，具有與大腸桿菌相似的大小，其生長的最佳溫度的菌株為30℃，在光顯微鏡下可被觀察。從生理生化特性調查中，該菌株被證實為一種兼性好氧微生物，這就是說它可以在有養氣或無氧氣的條件下很好生長。

基於該菌株的形態、生理特性和16SrDNA的序列的研究結果，在該發明中分離到的菌株被命名為“YersiniaintermediaH-27”，已於2006年4月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為：CGMCC1702。

該發明涉及具有如下性質的植酸酶，其理論分子量46kDa；最適pH在4-5之間，優選pH4.5；最適溫度在50-60℃之間，優選55℃；理論pI值為7.7；高於3000U/毫克 的高比活，優選3300U/毫克以上，如3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500U/毫克；此酶對胃蛋白酶、胰蛋白酶具有非常強的抗性。所述植酸酶可分離自耶爾森菌屬微生物，優選為中間型耶爾森氏菌。

該發明也提供了一種包含SEQIDNO.3所示胺基酸序列的分離蛋白。優選地，所述酶是由SEQIDNO.2所示的多核苷酸或其簡併序列所編碼。在另一實施例中，該發明也提供了所述蛋白的衍生物，其可由SEQIDNO.3所示的多肽序列經過一個或多個（例如，一個或幾個，或者如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的選自1～10的值，或者介於上述值中間的範圍）胺基酸殘基的取代、缺失和/或插入獲得，並仍然具有植酸酶活性。例如，一個常見的策略是保守胺基酸取代，即將胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基替換。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族在該領域已有明確定義。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸（例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側鏈的胺基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸（例如，甘氨酸、天冬醯胺、谷氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非極性側鏈的胺基酸（例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支側鏈的胺基酸（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香側鏈的胺基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，在植酸酶蛋白中用來自同一側鏈類的另一胺基酸殘基替換一個或幾個位點，將不會在實質上影響其植酸酶活性。此外，該領域技術人員公知，在基因的克隆操作中，常常需要設計合適的酶切位點，這勢必在所表達的蛋白末端引入了一個或多個不相干的殘基，而這並不影響目的蛋白的活性。又如為了構建融合蛋白、促進重組蛋白的表達、獲得自動分泌到宿主細胞外的重組蛋白、或利於重組蛋白的純化，常常需要將一些胺基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內的其它合適區域內，例如，包括但不限於，適合的接頭肽、信號肽、前導肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、麥芽糖E結合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標籤，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點。

又在一個實施例中，該發明的具有植酸酶活性的蛋白包括由如在嚴謹條件下與序列表中的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。如此處所用，術語“在嚴謹條件下雜交”是用來描述典型地相互間至少60％同源的核苷酸序列仍可相互雜交的雜交和清洗條件。優選地，嚴謹條件為這樣的條件，在此條件下相互間具有至少約65％、更優選地至少約70％、且甚至更優選地至少約75％或更高 同源性的序列一般仍可相互雜交。此嚴謹條件為該領域普通技術人員所公知，可在CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.（1989），6.3.1-6.3.6中找到。嚴謹雜交條件的一個優選、非限制性實例為：在6×SSC中於約45℃雜交，然後在0.2×SSC、0.1％SDS中於50-65℃洗滌一次或多次。該領域技術人員能夠理解，高度嚴謹條件可通過提高雜交溫度，例如至50℃、55℃、60℃或65℃來實現。

另外，該領域普通技術人員將會理解：由於自然變異所致的遺傳多態性可在群體中的個體間存在。此類自然變異一般可在植酸酶基因的核苷酸序列中導致1-5％的差異。植酸酶中任何以及所有這種自然變異產生的、並且不改變植酸酶功能活性的核苷酸突變和所得胺基酸多態性也在該發明的範圍之內。因此，該發明也包括由SEQIDNO.2所示多聚核苷酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽。

在另一優選的實施方案中，植酸酶蛋白為至少約60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％，或至少約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，或者至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，更優選地至少約98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％，甚至更優選地至少約99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源於該發明的SEQIDNO.3所示的全長胺基酸序列的活性蛋白。介於上述值中間的範圍和同一性值（例如，69-90％同源性或98.1-99.9％一致性）也包括在該發明中。例如，也包括使用任一上述值的組合作為上限和/或下限的同一性值範圍。在兩個序列間比較序列、並確定百分同源性為該領域公知的技術，可利用數學算法完成，如市售可得的軟體，或整合在公共資料庫中的軟體，例如多序列比對程式CLUSTALWBLOCKS或BLAST等。該領域普通技術人員應知道針對所分析的具體序列如何最佳化各程式中相應的參數設定（如分值、字長、缺口罰分、權重等等）。利用GenBank中BLAST的預設參數設定，獲得比對結果如下：

表1：本發明植酸酶蛋白與已知植酸酶蛋白的一致性比較結果

來源	Genbank登錄號.	一致性
Obesumbacterium proteus	AY378096	53%
Escherichia coli	AAN28334	45％

另一方面，該發明提供一種新的植酸酶基因SEQIDNO.2。該發明進一步包括由於遺傳密碼的簡併性而不同於該發明的SEQIDNO.2所述核苷酸序列之一的核酸分子、及其編碼的植酸酶蛋白。在一個實施方案中，該發明的分離的核酸分子為如在嚴謹條件下與SEQIDNO.2所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，優選其等位基因或天然突變體。在另一實施例中，該發明的分離核酸分子具有編碼具SEQIDNO.3所示的胺基酸序列的蛋白質的核苷酸序列。在再一實施例中，該發明的核酸分子編碼與SEQIDNO.3的胺基酸序列基本一致的全長植酸酶蛋白質，例如，通過取代、刪除和/或插入一個或多個（如一個或幾個，或者選自1～10的值）胺基酸殘基而源自SEQIDNO.3的蛋白，或者，與SEQIDNO.3的胺基酸序列至少99％同源的蛋白。該核酸分子優選為至少約60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％，或至少約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，更優選至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.7％、97.8％、97.9％，或至少約98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％，甚至更優選地至少約99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源於SEQIDNO.2的核苷酸序列，介於上述值的範圍或同一性值（如76～97％同源或97.8～99.9％相同）也包括在該發明中。利用GenBank中BLAST的預設參數設定，獲得以下比對結果。

表2：比對結果

來源/編碼的多肽	Genbank登錄號	一致性
變形肥桿菌(Obesumbacterium proteus)/植酸酶	AY378096	56%
大腸桿菌(Escherichia coli) phytase	AF537219	50%

又在一個方面，該發明涉及含有所述植酸酶基因的重組載體、已導入所述載體或所述基因的重組宿主細胞（例如，巴斯德畢赤酵母PichiaPastoris）、以及在宿主細胞中表達酶的方法。術語“載體”指能運送已與其連線的另一核酸的核酸分子，例 如其可以為質粒或病毒載體。該發明的重組表達載體包含以適於核酸在宿主細胞中表達的形式的該發明的核酸，這意味著重組表達載體包括一個或多個基於用於表達的宿主細胞而選擇的調節序列，其與表達的核酸可操作地連線。在重組表達載體中，“可操作地連線”是指目的核苷酸序列與調節序列以允許該核苷酸序列表達（例如，在體外轉錄/翻譯系統中，或當載體導入宿主細胞後在宿主細胞中）的方式連線。術語“調節序列”包括啟動子、阻遏物結合位點、激活物結合位點、增強子和其它表達調控元件（例如，終止子、多聚腺苷酸化信號、或mRNA二級結構的其它元件）。該領域普通技術人員將理解表達載體的設計可取決於如欲轉化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質表達水平等因素。可以將該發明的表達載體導入宿主細胞，以產生包括融合蛋白的蛋白或肽。

該發明的重組表達載體可設計用於在原核或真核細胞中表達植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在如大腸桿菌的細菌細胞、酵母（如畢赤酵母、黑麴黴）、昆蟲細胞（如使用桿狀病毒表達載體的Sf9細胞或家蠶細胞）或植物細胞（如膿桿菌介導的擬南芥、菸草、玉米等）中表達。從而，該發明涉及已導入該發明的重組表達載體的宿主細胞、優選畢赤酵母。宿主細胞可為任何原核或真核細胞，其包括但不限於上述的那些宿主細胞。優選畢赤酵母細胞。巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）是一種甲醇酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源進行代謝。這個系統因為其表達高水平的異源蛋白的能力而聞名。作為有效的表達系統，許多植酸酶基因已成功地在畢赤酵母中表達。同樣該發明提供的新的植酸酶基因也在畢赤酵母中表達，並具有高表達水平。在500ml燒瓶中，誘導48h後，細胞外植酸酶活性達到389U/mL。因此，通過發酵大規模生產植酸酶非常容易，並且成本比任何時候都低。

載體DNA可通過常規轉化或轉染技術導入原核或真核細胞中。如此處所用，術語“轉化”和“轉染”、“接合”和“轉導”意指該領域內公知的各種將外源核酸（例如，線性DNA或RNA（例如，線性化載體或無載體的單獨的基因構建體））或載體形式的核酸（例如，質粒、粘粒、噬菌體、噬粒、噬菌粒、轉座子或其它DNA）導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、脂轉染、天然感受態、化學介導的轉移或電穿孔。轉化或轉染宿主細胞的合適方法可在《分子克隆》實驗室手冊第二版，冷泉港實驗室出版社，NY，1989，Sambrook等人，和其它實驗室手冊中找到。

該發明的宿主細胞（如培養的原核或真核宿主細胞）可用於產生（即表達）植酸酶蛋白。因此，該發明還提供了使用該發明的宿主細胞製備植酸酶蛋白的方法。在一個實施例中，該方法包括在合適的培養基中培養該發明的宿主細胞（其中已導入了編碼植酸酶蛋白的重組表達載體，或其基因組中已導入了編碼野生型或改變的植酸酶蛋白的基因），直至產生植酸酶蛋白。在另一實施方案中，該方法還包括從培養基或宿主細胞分離植酸酶蛋白。

該發明的再一方面為在畢赤酵母中表達的植酸酶。為了測定植酸酶的性質，通過如硫酸銨沉澱，透析、超濾和層析的簡單方法純化植酸酶。經過簡單的淨化，植酸酶的純度足以研究酶學性質的研究。純化的重組植酸酶分子量為45kDa，並且當使用植酸作為底物時被活化。植酸酶為在50-60℃下時顯示高酶活性的酸性酶，並且在55℃下觀察到最佳活性。在pH1-10之間都具有非常穩定的酶活性，在pH4-5之間可以觀察到最佳活性，並且最適pH為4.5。Fe、Zn和Cu強烈抑制酶活性，但其他金屬離子對該酶沒有明顯的影響。同時，在較高溫度下該酶具有較好的穩定性，當該酶在80℃放置一小時，仍有40％的酶活性保留。此外，該植酸酶對胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常強的抗性。

此外，該發明還涉及所述植酸酶或生產植酸酶的宿主細胞在製備飼料添加劑中的套用，以及含有作為有效組分的所述蛋白和/或宿主細胞的飼料添加劑。該發明的飼料添加劑由於其含有增強飼料穀物中磷的利用的植酸酶，從而可以有效地用於動物飼料的生產。

所述飼料添加劑可製備為乾粉或液體製劑，並且可額外地包括一種或多種酶製劑。所述額外的酶製劑也可以為乾燥的或液體製劑形式，並且可以選自包括以下酶的組：角蛋白酶、脂解酶（如脂肪水解酶）、和產生葡萄糖的酶，如水解澱粉和糖原的α-1，4糖苷鍵的澱粉酶、水解有機磷酸的磷酸酶、降解纖維素的羧甲基纖維素酶、降解木糖的木聚糖酶、將麥芽糖水解為兩種葡萄糖的麥芽糖酶、以及將蔗糖水解為葡萄糖-果糖混合物的轉化酶。

除了植酸酶和/或產植酸酶微生物，該發明的飼料添加劑還可額外包括其它非致病性的有益微生物。所述附加微生物可以選自包括以下的組：可以產生蛋白酶、脂肪酶和轉化酶的枯草桿菌、如雙歧桿菌的益生菌、具有在厭氧條件下降解有機物能力和生理活性的乳酸菌、增加家畜重量、促進牛奶生產並有助於飼料的消化和吸收的如米麴黴菌的絲狀真菌、以及如釀酒酵母的酵母。

該發明進一步提供了一種從基因組DNA中獲取植酸酶基因的簡便有效方法。具有兩種獲取新植酸酶基因的常規方法：一種方法是從基因組庫中分離新植酸酶基因，另一種是以蛋白開始。但是，常規方法都比較耗費時間和勞力、困難、並且昂貴。為了解決上述問題，我們嘗試發展一種通過結合各種2006年4月之前的技術能夠容易地獲得植酸酶基因的方法。具體而言，通過分析大量的為主要植酸酶主要種類的組氨酸酸性磷酸酶的胺基酸序列，利用BLOCKS[http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html]，我們在組氨酸酸性磷酸酶中找到了兩個保守序列RHGXRXP和HD。基於這兩個保守序列和在不同生物中的偏愛密碼子，我們設計了簡併引物：正向簡併引物，FI（ForwardPrimer）：5’-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3’（20mer）（SEQIDNO.4）和反向簡併引物RI（ReversePrimer）：5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’（20mer）（SEQIDNO.5），通過PCR從染色體DNA中擴增部分植酸酶基因序列（其中，各縮寫的含義如下表3所示）。這個部分序列在已知的組氨酸酸性磷酸酶中約為900bp，可以根據該部分序列的大小通過在瓊脂糖凝膠上電泳篩選擴增的序列。然後，所獲得的900bp的序列進行測序和BLAST分析。根據BLAST分析結果，我們可以判斷所獲的900bp序列是否為新的植酸酶基因。

如果分析顯示該900bp的序列為部分的新植酸酶基因，則下一步為獲得新植酸酶基因的全序列。為了獲得可能的植酸酶基因的全序列，通過TAIL-PCR（Liuetal.，1995）分別克隆該部分序列的上下游區域。

與常規方法相比，新方法是非常方便、有效、價格低廉、易於獲取新型植酸酶基因。通過這種方法，我們2006年前已經成功地獲得了兩個新植酸酶基因（一個來自該申請描述的中間型耶爾森氏菌H-27（YersiniaintermediH-27），另一來自該專利發明人的另一申請中描述的無丙二酸檸檬酸桿菌（Citrobacteramalonaticus））。

表3

表示多義性的縮寫
M=A或C	V=A或C或G
R=A或G	H=A或C或T
W=A或T	D=A或G或T
S=C或G	B=C或G或T
Y=C或T	N=A或C或G或T
K=G或T

附圖說明

圖1顯示利用純化的植酸酶及其脫糖基化植酸酶的SDS電泳結果。泳道1為分子量標準，泳道2為純化的植酸酶，泳道3為脫糖基化處理的植酸酶。

圖2顯示新酶的最適pH和pH穩定性。在使具有最大活性的pH條件下測定的 活性為100％，在各pH值處的活性顯示為相對活力（％）。

圖3A顯示新植酸酶的最適溫度。在使具有最大活性的溫度條件下測定的活性為100％，在各溫度的活性顯示為相對活力（％）。

圖3B顯示新植酸酶在80℃時的熱穩定性。

圖4顯示新植酸酶的蛋白酶穩定性。

技術領域

《一種新的植酸酶的克隆和表達》涉及一種新型植酸酶基因、該基因編碼的植酸酶蛋白，生產該植酸酶的中間型耶爾森菌，一種在宿主細胞（如畢赤酵母）表達植酸酶的方法，以及把該植酸酶作為一種有效成分的飼料添加劑。此外，該發明還提供了一種從目標生物體簡單而快速的分離植酸酶基因方法。

權利要求

1、一種分離的具有如下特徵的植酸酶蛋白：

（a）理論分子量45.5kDa；

（b）最適pH在4-5之間；

（c）最適溫度在50-60℃之間；

（d）理論pI值為7.2；

（e）比活在3000U/毫克以上；

（f）對胃蛋白酶、胰蛋白酶具有高抗性。

2、一種分離的蛋白，其選自：

（a）包含SEQIDNO.3所示胺基酸序列的多肽；

（b）由SEQIDNO.2所示的多核苷酸或其簡併序列所編碼的多肽；

（c）由在嚴謹條件下與SEQIDNO.2所示多核苷酸的互補鏈雜交的多核苷酸編碼的具有植酸酶活性的多肽；

（d）由SEQIDNO.2所示多核苷酸的等位基因或天然突變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；或

（e）由SEQIDNO.3所示的多肽序列經過一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入衍生的具有植酸酶活性的多肽；

（f）與SEQIDNO.2所示胺基酸具有至少60％，優選65％，70％，75％，80％，85％，或至少90％，特別優選95％一致性的具有植酸酶活性的多肽。

3、如權利要求1或2所述的蛋白，其來自耶爾森氏菌屬微生物，優選中間型耶爾森氏菌。

4、一種分離的核酸分子，其編碼如權利要求1至3中任一項所述的蛋白。

5、一種DNA構建體或重組載體，其含有如權利要求4中所述的核酸分子。

6、一種宿主細胞，其含有如權利要求5中所述的DNA構建體或重組載體，或已整合至其基因組內的如權利要求4中所述的核酸分子。

7、如權利要求6所述的宿主細胞，其為真核生物細胞。

8、如權利要求7所述的宿主細胞，其為畢赤酵母細胞。

9、中間型耶爾森氏菌H-27，其保藏號為CGMCC1702。

10、一種產生植酸酶的方法，包括在適於植酸酶表達的條件下，培養如權利要 求6至8中任一項所述的宿主細胞。

11、一種飼料添加劑，其含有選自如下的有效成分：

（a）如權利要求1至3中任一項所述的蛋白；

（b）如權利要求6至8中任一項所述的宿主細胞。

12、如權利要求11所述的飼料添加劑，其還含有一種或多種選自包含以下組分的酶製品：角蛋白酶、脂解酶、澱粉酶、磷酸酶、麥芽糖酶、轉化酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶的。

13、如權利要求1至3中任一項所述的多肽/或如權利要求6至8中任一項所述的宿主細胞在製備飼料添加劑中的用途。

14、一種從靶生物體中分離植酸酶基因的新方法，包括：

（a）基於植酸酶保守序列RHGXRXP和HD設計一對簡併引物；

（b）利用所述引物通過PCR擴增部分植酸酶序列；

（c）進一步通過TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。

15、如權利要求14所述的方法，其中所述的簡併引物對如SEQIDNO.4和5所示。

實施方式

實施例1：植酸酶產生菌的分離

植酸酶產生菌株是從中國一號冰川（新疆）的凍土樣品中分離的。具體地，為了分離植酸酶產生菌種，於2005年4月採集了中國一號冰川（新疆）的凍土樣品，並在冰櫃中儲存數日，直到其可以在實驗室被加工操作。冰凍土壤被懸浮在無菌水中，並稀釋，然後，不同樣品的懸浮液接種無瓊脂的LB培養基中，接著分別在4℃、10℃、15℃和30℃下培養1-2天。接著利用硫酸亞鐵鉬藍法（詳見下面的實施例4）測定在不同溫度下、在不同樣品的培養液和細胞破碎液中的植酸酶活性。在細胞破碎液中的植酸酶活性是可檢測的，其顯示這些菌株具有細胞內植酸酶活性。首先挑選植酸酶活性的樣品，並且判定適當的培養溫度為30℃。具有植酸酶的活性的樣品被稀釋，並塗覆於具1.5％瓊脂的LB培養基上，在30℃的培養箱中培養一天。挑選具有各種形態的不同克隆，接種於5毫升LB培養基過夜培養。測量細胞破碎液中各菌落的植酸酶活性，最後在所選菌落中挑選顯示最高植酸酶活性的菌株。該菌株的編號為H-27。

實施例2：分析植酸酶產生菌H-27的特徵

通過革蘭氏染色法，在實施例1中分離的H-27菌被確定為是革蘭氏陰性菌。此菌是典型的桿菌，在顯微鏡下具有與大腸桿菌相似的大小。進一步研究了其部分生理生化特性。結果表明，該菌為革蘭氏陰性、兼性、厭氧微生物，其可以在無氧或有氧的環境中生長。此菌的最適生長溫度為30℃，我們也分析了該菌的16srRNA序列。使用PromegaTaq試劑盒，通過PCR擴增該菌的16SrDNA序列（SEQIDNO.1），並且，通過使用BLAST和多序列比對程式CLUSTALW比對該菌的16SrDNA序列和在GenBank中的參考序列。結果16srDNA的鹼基序列顯示了與中間型耶爾森氏菌之間具有99.5％的一致性，與阿氏耶爾森菌（Yersiniaaldovae）和莫氏耶爾森菌（Yersiniamollaretii）的16srDNA序列之間具有99％的一致性。基於所選菌株的形態、生理和16SrDNA的研究結果，我們可以確定此菌為新的中間型耶爾森氏菌（Yersiniaintermedia）。

根據以上結果和研究過程中使用的記錄號，此菌株被命名為“中間型耶爾森氏菌H-27”，並在2006年4月25日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）予以保藏，保藏號為CGMCC1702。

實施例3：植酸酶基因的克隆

當蛋白的基因為多基因家族的已知成員時，同源克隆是非常有效簡單。

明顯地，根據植酸酶的分類，大部分細菌源的植酸酶都屬於組氨酸酸性磷酸酶（HAP）家族。通過多序列比對程式CLUSTALW和BLOCKS（http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html）分析HAP家族的各種序列，我們發現HAP酶中具有兩個保守區域，即RHGXRXP和HD區域。基於這兩個保守區域，能夠設計一對簡併引物，從而通過PCR從中間型耶爾森菌（Yersiniaintermedia）基因組DNA中擴增部分植酸酶序列。

<3-1>部分植酸酶基因序列的獲得

根據兩個保守區域設計簡併引物，並使用DNA合成儀合成。以中間型耶爾森菌（Yersiniaintermedia）基因組DNA作為模板進行PCR擴增。除了簡併引物和基因組DNA模板外，其他用於PCR擴增的試劑都購自TIANGENBIOTECHCO.，LTD。通過最佳化PCR參數，我們確定了PCR退火溫度為50℃，並且PCR的反應條件為：1個循環，95℃，2分鐘；30個循環，95℃，30秒/退火溫度，30秒/72℃，1分鐘；最後在72℃延伸5分鐘，PCR產物保存於4℃。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，發現一系列由簡併引物擴增的片段。使用適當的DNA標準分子量，能夠選擇期望大小（900bp）的條帶。結果，通過TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收約900bp的DNA條帶大小，再將其克隆至pGEMTeasy載體（Promega），然後轉化大腸菌JM109。分離具有靶DNA片段的轉化菌株，並提取含靶DNA片段的質粒，測序約900bpDNA序列。結果確定了901bp的DNA序列為部分植酸酶基因。

<3-2>完整的植酸酶序列的克隆

為了獲得完整的植酸酶基因序列，通過熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）（Liuetal.，1995）分別克隆以上所獲得的901bp片段的上游和下游區域。TAIL-PCR是一種非常強大的用於揭示已知序列兩端的未知序列的工具，並且是非常簡單、快速、便宜、有效的方法。根據以上所獲得的901bp片段的DNA序列，設計了用於TAIL-PCR的巢式特異性引物，它們分別為：

usp1（5’-CTATTCCATCAAGGAATGCCTGCCCCG-3’）（upspecialprimer），

usp2（5’-CGCGTTCGTTGATCAACATCGGCCtg-3’），

usp3（5’-GGGTTAAGTATCCTGCGGCG-3’），

dsp1（5’-GTTGCCTGGCATCGGTTAACGGGAG-3）（downspecialprimer），

dsp2（5’-CGCTCGTCATAAGGGCACACCGTTGC-3’），

dsp3（5’-CCGTCTCATTATTGTTTATTGCTGG-3’）。

另外一端的任意簡併引物（（AD，arbitrarydegenerateprimers）包括：AD6（5’-CAWCGICNGAIASGAA-3’）；AD9（5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’））是TAIL-PCR成功擴增的關鍵。巢氏特異性引物和AD引物一起使用，他們的區別在於其退火溫度不同。TAIL-PCR擴增的程式和Liu（Liuetal.，ThermalasymmetricinterlacedPCR：automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995Feb10；25（3）：674-81）相同，此處通過引用包含其全部內容。交替高、低溫退火溫度循環產生在一端具有特異性引物、在另一端具有AD引物的特異性產物。通過瓊脂糖凝膠電泳分析TAIL-PCR的產物，我們獲得已知序列的約900bp的上游DNA，並且，通過最佳化TAIL-PCR參數，也獲得已知片段的約650bp的下游DNA。通過TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別純化回收兩個片段，並將所回收的片段連線到pGEMTeasy載體（Promega）。，然後轉化大腸菌感受態細胞JM109。兩個片段被分別測序。

三個序列都被輸入DNASTAR軟體，並通過序列拼接程式組裝，這樣確定開放閱讀框。該1326bp閱讀框含有一段信號肽序列和活性蛋白。

<3-3>所獲得完整序列的分析

所獲得的完整片段全長2354bp，含有一個通過ORF查找程式在VectorNTI中發現的1326bp的開放閱讀框（SEQIDNO.2）。該閱讀框編碼了一段信號肽和一個成熟蛋白，通過SignalP程式[http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]和多序列比對，確定信號肽N端的可能的切割位點為Ser23-Ala2。該關於成熟活性蛋白的N端位置的數據對於蛋白質在異源表達系統中表達是必要的。利用PeptideMass程式[http://cn.expasy.org/tools/peptide-masshtml]確定了成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的預測分子量為45.5kDa，它和SDS-PAGE的結果（圖1）基本一樣。通過VectorNT預測該成熟蛋白的理論等電點約為7.7。

在NCBI的GenBank中利用BLAST伺服器[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]進行相似性分析。結果表明：ORF的胺基酸序列（SEQIDNO.3）顯示與變形肥桿菌（Obesumbacteriumproteus）的已知植酸酶的低一致性（54％），並且具有與大腸桿菌植酸酶的低一致性（45％）。因此可以確定這個來源於耶爾森氏菌的開放閱讀框編碼 了一個新的植酸酶。和其他植酸酶一樣，該開放閱讀框的胺基酸序列被命名為AppA。儘管與來源於中間型耶爾森菌ATCC29909的一個假定蛋白具有較高的一致性，但是該假定蛋白是通過自動的計算機分析而由注釋基因組序列（NZAALF01000052）推測獲得的，沒有驗證酶活性或任何關於生理或化學特性的信息。

實施例4：植酸酶AppA在畢赤酵母中的表達

<4-1>表達載體的構建

為了獲得成熟蛋白的編碼區，設計合成了引物，yermF：5’-GCGGAATTCGCCGCGCCGGTTGCCATA-3’（27mer），和yermR：5’-GTAGCGGCCGCTTAAATATGGCAAGCAGGTTC-3’（32mer）。利用引物yermF和yermR，成熟蛋白的編碼區被擴增。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下預計大小的條帶，並用TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒提取DNA。如廠商說明所述，純化的DNA插入表達載體pPIC9（Invitrogen，SanDiego，Calif.）的EcoRI和NotI酶切位點處。構建體被轉化至塗覆於含100μgamp/mL的LB培養基上的JM109細胞內。陽性轉化子被測序，並生長用於酵母轉化的DNA的製備。

<4-2>轉化酵母及表達

根據廠商說明，用YPD培養基培養畢赤酵母菌株GS115（Invitrogen），並準備用於轉化。使用DraI線性化約8μg的表達質粒pPIC9DNA然後通過電擊轉化到畢赤酵母中。將轉化的細胞塗布於RDB培養基上，以篩選HIS4基因整合到宿主染色體DNA中。含有轉化的HIS4基因的轉化子才能在RDB平板上生長。在RDB平板上培養3天后，轉化子在含甘油的基礎培養基（BMGY培養基）上培養48小時，然後旋轉（2500g，5分鐘）收集細胞，並在0.5％甲醇培養基（BMMY）中懸浮，以誘導植酸酶表達。

<4-3>轉化子植酸酶活性的檢測

通過硫酸亞鐵鉬藍法分析了總共72個轉化子的植酸酶活性。其測定過程如下：在950μL的底物溶液（4mM的植酸鈉，溶解在0.25M的乙酸鈉緩衝液中，pH為5.0）被加至50μL稀釋的酶溶液中，並混合均勻，在37℃反應30分鐘。接著向以上反應體系中加入1mL10％的TCA（三氯乙酸），終止反應。作為對照，在酶液中先加入1mL10％的TCA，使酶蛋白失活，接著在加入底物溶液，37℃放置30分鐘。反應終止後，再加入2mL的顯色液（0.576M的硫酸，1％的鉬酸銨，7.32％的七個結晶水硫酸亞鐵），放置10分鐘。在700nm下檢測吸光值，並測定酶溶液和對照的 活性。一個酶活單位指37℃時，1分鐘釋放1μM無機磷所需的酶蛋白的量。經過兩天的甲醇誘導後，72個轉化子中有11轉化子被檢測到植酸酶活性，酶活單位範圍約在48-270U/mL之間。明顯地，以上所獲得的開放閱讀框為一個新的有功能的植酸酶基因，其編碼具有植酸酶活性的蛋白。這個由以上開放閱讀框的成熟區域編碼的具植酸酶活性的多肽被命名為r-AppA。

實施例5：重組植酸酶r-AppA的純化

為了純化酵母表達的重組植酸酶r-AppA，上清液酶活為270U/mL的轉化子在較優的培養和誘導條件下培養。經過兩天的甲醇誘導之後，利用與實施例4所述相同的方法檢測植酸酶活性，上清液的酶活達到389U/mL。經過12000g離心10分鐘，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌體被去除。

硫酸銨粉末被加入到上清液中，到達80％的飽和度，然後以12000g離心10分鐘收集沉澱。沉澱用0.1M，pH5.0的乙酸鈉緩衝液溶解，以12000g離心10分鐘。然後，獲得上清液，並使用相同的緩衝液進行透析。接下來，使用具有10kDa截留濾器的的超濾裝置濃縮所得滲析液。最後，濃縮液通過SephacrylS-200（PharmaciaBiotech）進行分離純化。最後，用相同緩衝液通過SephacrylS-200純化植酸酶。

實施例6：重組植酸酶r-AppA酶學性質分析

<6-1>重組植酸酶r-AppA分子量的確定以及脫糖基處理

純化的重組植酸酶r-AppA分子量通過SDS-PAGE電泳進行測定。電泳結果圖1：泳道1為標準分子量；泳道2為純化的重組植酸酶r-AppA；泳道3為脫糖基的r-AppA。根據電泳檢測的結果，純化的r-AppA被證實其分子量約為45kDa。通過NetNglyc（預測N糖基化位點的程式）程式，預測了r-AppA的蛋白質序列。該蛋白沒有潛在的N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/Thr）。因為純化的酶和經脫糖基化的酶的分子量一樣，所以同樣的結果在圖1中也能看到。

<6-2>重組植酸酶r-AppA的溫度和pH特性

在不同的溫度和pH條件下，研究經SephacrylS-200純化的重組植酸酶r-AppA的酶活性。利用以下緩衝液確定pH值對植酸酶的影響：甘氨酸-鹽酸pH1.5-3.5；乙酸鈉-乙酸pH3.5-6.0；Tris-鹽酸pH6.0-8.5；和甘氨酸-氫氧化鈉pH8.5-10。所有用於稀釋的緩衝液都含有0.05％BSA和0.05％Triton。如圖2所示，植酸酶的活性隨pH值的變化而變化。重組酶的最適pH為4.5，在pH2.5時仍有70％的酶活性，在pH5.5時仍有65％的酶活性。明顯地，2006年4月之前的植酸酶相比，重組的植酸酶r-APPA在 pH2.0-6.0的適宜範圍內有更高的酶活性。圖2顯示了該酶具有較好的穩定性，當該酶放置在37℃，pH2.5-10.0處理2小時後，仍有超過85％的酶活性存在。在pH1.0-2.0處理後也有超過70％的活性保留。

圖3A顯示了酶活性隨溫度的變化關係。在最適pH4.5下測定了20℃到80℃範圍內的酶活性，結果表明最適溫為55℃。如圖3B所示，酶液在80℃處理10分鐘時，仍保留超50％的酶活性，在80℃處理1小時，仍保留40％的酶活性。與在飼料工業中被廣泛用作飼料添加劑的大腸桿菌植酸酶相比，r-AppA在高溫下具有更好的熱穩定性。

根據對r-AppA的溫度和pH測試，以及與其他常規的植酸酶相比，該發明的植酸酶r-APPA被認為是非常適於單胃動物的飼料添加劑。因為與常規使用的植酸酶相比，該發明提供的植酸酶具有寬的pH穩定性和高溫穩定性，所以該植酸酶，r-APPA具有非常好的商業套用價值的套用潛力。

<6-3>金屬離子及抑制劑對重組植酸酶r-AppA活性的影響

金屬離子及抑制劑對重組植酸酶r-AppA活性的影響在最適pH（pH4.5）下進行。

如表4所示，在各種金屬離子中，酶活受濃度為1mM的許多金屬離子的抑制較弱，Fe，Zn和Cu明顯抑制酶活性。Mn對酶活性有弱的增強作用。作為抑制劑，SDS對酶活性有強的抑制作用，但是EDTA對酶活性基本沒有影響。

表4金屬離子及抑制劑對重組植酸酶活性的影響

Na	95%
K	99%
Ca	98%
Li	95%
Co	93%
Cr	88%
Ni	98%
Cu	61%
Mg	94%
Fe	47%
Mn	104%
Zn	44%
EDTA	101%
SDS	9%
Ag	84%
對照	100%

<6-4>蛋白酶對重組植酸酶r-AppA活性的影響

為了確定蛋白酶抗性，純化的重組酶（0.025毫克/ml）與0.1毫克/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶在37℃孵育。然後，分別在5、10、20、30、60、和120分鐘時取樣。如圖4所示，該重組植酸酶r-AppA對胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很強的抗性。該植酸酶顯示高於任何其它曾報導的植酸酶的蛋白酶抗性。結果暗示該植酸酶因其對胃腸中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抗性，從而可以提高植酸酶在單胃動物體內的水解效率。

<6-5>重組植酸酶r-AppA比活的測定

為了確定該植酸酶r-AppA的比活，首先通過Lowry方法確定了通過SephacrylS-200純化的重組酶r-AppA的酶蛋白的濃度。並且在pH4.5的條件下，通過硫酸亞鐵鉬藍法確定重組酶r-AppA的酶活。結果，該重組植酸酶r-AppA的比活為3960±248U/毫克，這是至今報導的比活最高的植酸酶。

工業套用

根據以上所述，該發明的新的植酸酶具有以下幾個優點：高比活，合適的作用pH，良好的熱穩定性，強的蛋白酶抗性，容易發酵生產。所有這些優點都意味著該植酸酶作為飼料添加劑，比以前所報導的植酸酶將會更有套用價值。第一，高比活意味著生產同樣量的酶蛋白，可以降解更多的植酸。即降解同樣量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也將更低。第二，合適的作用pH意味著該植酸酶可以更好的在動物腸道內發揮作用。第三，良好的熱穩定性意味著該酶在制粒加工的過程中不容易失活。第四，強的蛋白酶抗性意味著該植酸酶在動物腸道內可以穩定的存在，而不被蛋白酶降解。最後，容易發酵生產說明，可以通過簡單的工業發酵大量生產該植酸酶，並用於飼料行業。基於以上優良特性，任何該領域的普通技術人員都知道，該發明所提供的植酸酶作為飼料添加劑將發揮重要的作用。這一新的分離於Yersiniaintermedia的植酸酶已經克服了2006年4月之前的技術的缺點，因此有著極大的商業價值。

榮譽表彰

2015年11月27日，《一種新的植酸酶的克隆和表達》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。