《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》是廣東溢多利生物科技股份有限公司於2010年11月24日申請的專利，該專利的申請號為2010105662611，公布號為CN102002487A，授權公布日為2011年4月6日，發明人是吳迪、汪雲飛、羅長財、張娟、陳麗芝、謝建華。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》涉及基因工程領域。其胺基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。該發明利用基因工程手段對大腸桿菌植酸酶APPA的進行改良，以解決大腸桿菌植酸酶APPA熱穩定性差，不能適用於工業生產的要求，經過最佳化改良的植酸酶PHYTH其熱穩定性得到很大的提高，可在飼料工業中顯示出巨大的套用潛力。
2016年12月7日，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用
- 公布號：CN102002487A
- 授權日：2011年4月6日
- 申請號：2010105662611
- 申請日：2010年11月24日
- 申請人：廣東溢多利生物科技股份有限公司
- 地址：廣東省珠海市南屏科技工業園屏北一路8號
- 發明人：吳迪、汪雲飛、羅長財、張娟、陳麗芝、謝建華
- Int.Cl.：C12N9/16(2006.01)I、C12N15/55(2006.01)I、C12N15/63(2006.01)I、C12N1/15(2006.01)I、C12N1/19(2006.01)I等
- 代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
- 代理人：高宇、楊小蓉
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
植酸（Phytate，Phyticacid，IP6）又稱肌醇六磷酸脂，結構複雜。植酸分子含有6個磷酸基團，帶有豐富的磷，植酸是飼料中磷的重要貯存形式。磷是動物機體必需礦物元素，單胃動物體內缺乏分解植酸的植酸酶（Phytase，催化植酸及植酸鹽水解的酶），造成飼料中磷的利用率僅有1/3或更低，為了補充有效磷的不足，必須在飼料中添加無機磷酸鹽，常用的為磷酸氫鈣和骨粉。這樣不僅大大增加了飼料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出體外，造成磷源的浪費及嚴重的環境問題。單胃動物飼料中通過添加植酸酶，可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排出對環境的污染。
植酸酶（EC3.1.3.8）即肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱。當飼料中存在足量的植酸時，添加適量植酸酶可以替代部分補加的無機磷酸鹽。同時也避免植酸磷與動物體內的多種金屬離子以及蛋白質螯合成相應的不溶性複合物，而導致動物對這些營養元素無法有效利用。
隨著生物技術的發展，特別是DNA重組技術的套用，使各種微生物來源的植酸酶基因的大規模表達成為可能。2010年11月前來源於Escherichiacoli，Aspergillusniger、Aspergillusfumigatus、Selenomonasruminantium等微生物的植酸酶已經在巴斯德畢赤酵母中得到表達。但是，顆粒飼料生產中需要經歷一個短暫的高溫階段，一般在85-95℃。植酸酶本身就是一種蛋白質，在高溫條件下會變性失活。現在大多數商品植酸酶都不能耐高溫，高溫制粒過程造成酶活的急劇下降，無法滿足實際套用要求。如何使植酸酶既能短暫耐高溫又能在動物體中具有高酶活是2010年11月前飼料用植酸酶製劑急需解決的一個問題。
來源於大腸桿菌植酸酶APPA具有高比活性的優點，並且已經被克隆並測序（The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene app Areveals significanthomology between pH2.5 Acid phosphatase and glucose-1-phosphatase.Journal of Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500）該基因全長1299bp，編碼432個胺基酸。N端的22個胺基酸為信號肽。APPA的最適溫度為60℃，但其熱穩定性較差，在60℃下保溫10分鐘其剩餘酶活性別僅為50％，在80℃下保溫10分鐘其剩餘酶活性在15％以下，因此，在動物飼料制粒過程中酶活性損失過大，剩餘不到20％的活性，使得其在具體的套用中受到限制，因此如何利用基因工程的手段來提高其熱穩定性，是解決其套用的關鍵點。
發明內容
專利目的
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的目的是通過對大腸桿菌植酸酶APPA的改造，使改造後的植酸酶在溫度的耐受性方面更加優良，最終達到工業化生產的要求。
該發明的目的是提供一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因。
該發明的再一目的是提供一種最佳化改良大腸桿菌Escherichiacoli的植酸酶APPA耐熱性的方法。
該發明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重組載體。
該發明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重組菌株。
該發明的再一目的是提供一種表達植酸酶PHYTH的方法。
該發明的再一目的是提供上述植酸酶PHYTH的套用。
技術方案
大腸桿菌植酸酶APPA的胺基酸序列如SEQIDNO.1所示：
MKA1L1PFLS | LL1PLTPQSA | FAQSEPELKL | ESVVIVSRHG | VRAPTKATQL | MQDVTPDAWP | 60 |
TWPVKLGWLT | PRGGEL1AYL | GHYQRQRLVA | DGLLAKKGCP | QSGQVAIIAD | VDERTRKTGE | 120 |
AFAAGLAPDC | AITVHTQADT | SSPDPLFNPL | KTGVCQLDNA | NVTDAILSRA | GGSIADFTGH | 180 |
RQTAFRELER | VLNFPQSNLC | LKREKQDESC | SLTQALPSEL | KVSADNVSLT | GAVSLASMLT | 240 |
EIFLLQQAQG | MPEPGWGRIT | DSHQWNTLLS | LHNAQFYLLQ | RTPEVARSRA | TPLLDLIKTA | 300 |
LTP1IPPQKQA | YGVTLPTSVL | FIAGHDTNLA | NLGGALELNW | TLPGQPDNTP | PGGELVFERW | 360 |
RRLSDNSQW1 | QVSLVFQTLQ | QMRDKTPLSL | NTPPGEVKLT | LAGCEERNAQ | GMCSLAGFTQ | 420 |
IVNEARIPACSL | 432 |
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》優選採用定點飽和基因突變和易錯PCR隨機突變及突變重組的方法對SEQIDNO.1所示的大腸桿菌來源的植酸酶APPA進行改造，並經過高通量突變篩選的方法篩選得到耐高溫植酸酶PHYTH，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的植酸酶PHYTH和原有大腸桿菌植酸酶APPA相比，去除前22個胺基酸的信號肽序列後，有12個胺基酸的差異，突變位點由+45L，+70D，+81S，+133V，+139A，+159H，+209T，+238T，+281T，+316E，+318N，+379T突變成+45I，+70E，+81T，+133L，+139S，+159K，+209S，+238L，+281S，+316C，+318Q，+379C，突變後的胺基酸序列如SEQIDNO.2所示：
QSEPELKLE | SVV1VSRHGV | RAPTKATQLM | QDVTPDAWPT | WPVKIGWLTP | RGGELIAYLG | 59 |
HYQRQRLVAE | GLLAKKGCPQ | TGQVAIIADV | DERTRKTGEA | FAAGLAPDCA | ITVHTQADTS | 119 |
SPDPLFNPLK | TGLCQLDNSN | VTDAILSRAG | GSIADFTGKR | QTAFRELERV | LNFPQSNLCL | 179 |
KREKQDESCS | LTQALPSELK | VSADNVSLSG | AVSLASMLTE | IFLLQQAQGM | PEPGWGRLTD | 239 |
SHQWNTLLSL | HNAQFYLLQR | TPEVARSRAT | PLLDLIKTAL | SPHPPQKQAY | GVTLPTSVLF | 299 |
IAGHDTNLAN | LGGALCLQWT | LPGQPDNTPP | GGELVFERWR | RLSDNSQWIQ | VSLVFQTLQQ | 359 |
MRDKTPLSLN | TPPGEVKLCL | AGCEERNAQG | MCSLAGFTQI | VNEARIPACS | L | 410 |
或者包括大腸桿菌植酸酶APPA的信號肽序列，在APPA胺基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T，其胺基酸序列如SEQIDNO.3所示：
MKAILIPFLS | LLIPLTPQSA | FAQSEPELKL | VRAPTKATQL | MQDVTPDAWP | 60 |
TWPVKIGWLT | PRGGELIAYL | GHYQRQRLVA | QTGQVAIIAD | VDERTRKTGE | 120 |
AFAAGLAPDC | AITVHTQADT | SSPDPLFNPL | NVTDAILSRA | GGSIADFTGK | 180 |
RQTAFRELER | VLNFPQSNLC | LKREKQDESC | KVSADNVSLS | GAVSLASMLT | 240 |
EIFLLQQAQG | MPEPGWGRLT | DSHQWNTLLS | RTPEVARSRA | TPLLDLIKTA | 300 |
LSPHPPQKQA | YGVTLPTSVL | FIAGHDTNLA | TLPGQPDNTP | PGGELVFERW | 360 |
RRLSDNSQWI | QVSLVFQTLQ | QMRDKTPLSL | LAGCEERNAQ | GMCSLAGFTQ | 420 |
IVNEARIPACSL | 432 |
該植酸酶PHYTH在溫度的耐受性方面更加優良，在75℃水溶液中保溫5分鐘，剩餘酶活在90％以上，而未改良的APPA植酸酶在75℃水溶液中保溫5分鐘，剩餘酶活不足原來的10％；將該最佳化改良的植酸酶PHYTH添加到飼料中，經90℃高溫制粒處理，其酶活仍保留90％以上，而未改良的APPA植酸酶經90℃高溫制粒處理，酶活保留不足原來的20％，說明《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的經過改良的植酸酶PHYTH達到了工業化生產的耐高溫要求。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了上述最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH的基因序列，其鹼基序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示：
atgcaaagcg | aacccgaatt | aaaattagag | tcagtcgtga | tcgtgtcaag | acacggcgtt | 60 |
cgtgctccaa | ctaaagcaac | tcagcttatg | caagacgtaa | ctcctgatgc | gtggcccaca | 120 |
tggccagtca | aaatagggtg | gttgactccg | agaggtggtg | aattgattgc | ttacttagga | 180 |
cattatcagc | ggcaaagatt | agtggctgag | gggctactag | cgaaaaaggg | atgtccacaa | 240 |
actggtcaag | tggctattat | cgcggatgtt | gatgaaagga | ctagaaaaac | cggtgaggct | 300 |
ttcgctgccg | gattagcaccc | gattgtgca | atcacagttc | atacgcaagct | gacacttct | 360 |
tcacccgatc | cactttttaa | tcctctaaaaa | caggtttgt | gtcaattgga | taactccaat | 420 |
gtgaccgacg | ctatattatc | aagagcagga | ggctctatcg | ccgattttac | tggtaaaagg | 480 |
caaacggctt | tcagggaatt | agagagagtg | ttgaattttc | cccagtccaa | tttgtgccta | 540 |
aaaagagaga | aacaagatga | atcctgttcg | ttgacacaag | ccttgccgtc | tgagctcaaa | 600 |
gtctcagcgg | acaacgtgag | tctgtcaggt | gcagtatcat | tagcttcaat | gttgacggaa | 660 |
attttcctgt | tgcaacaggc | tcagggaatg | ccagaacctg | ggtggggtag | attaactgac | 720 |
agtcaccagt | ggaatacctt | attgtcgttg | cacaatgctc | agttctatct | tctgcagagg | 780 |
acacctgagg | ttgctcgaag | tagagcaacc | cctcttttgg | atctaattaa | aaccgccttg | 840 |
agcccccaccc | acctcaaaaa | caagcatac | ggtgtcacat | tacctacatc | ggttcttttt | 900 |
attgccgggc | atgatactaa | cttagccaat | ttagggggcg | ctctatgctt | gcagtggaca | 960 |
ctacctggtc | aaccggataa | tactccgcca | ggcggagaat | tagtgttcga | acggtggaga | 1020 |
cggttgtcgg | ataattctca | atggatccaa | gtatcattgg | ttttccagac | tttgcagcaa | 1080 |
atgagggata | agacccccct | atcgctgaac | actcccccag | gtgaagttaa | gctctgcttg | 1140 |
gcaggctgcg | aagaaagaaa | tgcccaggga | atgtgctcct | tagccggctt | cactcagatt | 1200 |
gtaaatgaag | ccaggattcc | tgcctgttcc | ctg | 1233 |
SEQIDNO.5：包含信號序列的突變後核苷酸序列
atgaaagcgatcttaatcccatttttatctcttctgattccgttaaccccgcaatctgcattcgct | ||||||
caaagcg | aacccgaatt | aaaattagag | tcagtcgtga | tcgtgtcaag | acacggcgtt | 60 |
cgtgctccaa | ctaaagcaac | tcagcttatg | caagacgtaa | ctcctgatgc | gtggcccaca | 120 |
tggccagtca | aaatagggtg | gttgactccg | agaggtggtg | aattgattgc | ttacttagga | 180 |
cattatcagc | ggcaaagatt | agtggctgag | gggctactag | cgaaaaaggg | atgtccacaa | 240 |
actggtcaag | tggctattat | cgcggatgtt | gatgaaagga | ctagaaaaac | cggtgaggct | 300 |
ttcgctgccg | gattagcac | ccgattgtgca | atcacagttc | atacgcaagc | tgacacttct | 360 |
tcacccgatc | cactttttaa | tcctctaaaaa | caggtttgtgt | caattgga | taactccaat | 420 |
gtgaccgacg | ctatattatc | aagagcagga | ggctctatcg | ccgattttac | tggtaaaagg | 480 |
caaacggctt | tcagggaatt | agagagagtg | ttgaattttc | cccagtccaa | tttgtgccta | 540 |
aaaagagaga | aacaagatga | atcctgttcg | ttgacacaag | ccttgccgtc | tgagctcaaa | 600 |
gtctcagcgg | acaacgtgag | tctgtcaggt | gcagtatcat | tagcttcaat | gttgacggaa | 660 |
attttcctgt | tgcaacaggc | tcagggaatg | ccagaacctg | ggtggggtag | attaactgac | 720 |
agtcaccagt | ggaatacctt | attgtcgttg | cacaatgctc | agttctatct | tctgcagagg | 780 |
acacctgagg | ttgctcgaag | tagagcaacc | cctcttttgg | atctaattaa | aaccgccttg | 840 |
agcccccacc | cacctcaaaa | acaagcatac | ggtgtcacat | tacctacatc | ggttcttttt | 900 |
attgccgggc | atgatactaa | cttagccaat | ttagggggcg | ctctatgctt | gcagtggaca | 960 |
ctacctggtc | aaccggataa | tactccgcca | ggcggagaat | tagtgttcga | acggtggaga | 1020 |
cggttgtcgg | ataattctca | atggatccaa | gtatcattggt | tttccagac | tttgcagcaa | 1080 |
atgagggata | agacccccct | atcgctgaac | actcccccag | gtgaagttaa | gctctgcttg | 1140 |
gcaggctgcg | aagaaagaaa | tgcccaggga | atgtgctcctt | agccggctt | cactcagatt | 1200 |
gtaaatgaag | ccaggattcc | tgcctgttcc | ctg | |||
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了一種最佳化改良大腸桿菌Escherichiacoli的植酸酶APPA耐熱性的方法，具體地，是通過定點飽和基因突變和易錯PCR隨機突變及突變重組的方法改變SEQIDNO.1所示的來源於大腸桿菌Escherichiacoli的植酸酶APPA的多個胺基酸，包括其胺基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了包含上述最佳化改良的植酸酶基因PHYTH的重組載體，將《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的最佳化改良的植酸酶基因PHYTH插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連線。作為《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的一個最優選的實施方案，優選為將《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的植酸酶基因PHYTH插入到質粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-PHYTH。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了包含上述植酸酶基因PHYTH的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵母菌株X33。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了表達上述植酸酶PHYTH的方法，包括以下步驟：
1）用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2）重組菌株進行發酵，誘導重組植酸酶的表達；
3）發酵結束後，回收並純化所表達的植酸酶PHYTH。
具體地，將重組酵母表達質粒pPICzαA-PHYTH，轉化到酵母宿主菌株X33中，用高濃度的抗生素平板篩選高拷貝的轉化子，將篩選到的轉化子，在7L的發酵罐中進行發酵，發酵過程中，每隔24小時取發酵液測定OD600以及菌體濕重，取上清液進行植酸酶活性檢測。發酵結束最終平均發酵酶活達到14300U/毫升，實現的植酸酶PHYTH的高效表達。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》還提供了上述植酸酶PHYTH在飼料添加劑中的套用。
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》為了解決2010年11月前技術的不足，利用基因工程手段對大腸桿菌植酸酶APPA的進行改良，以解決大腸桿菌植酸酶APPA熱穩定性差，不能適用於工業生產的要求，經過最佳化改良的植酸酶PHYTH其熱穩定性得到很大的提高，在75℃水溶液中保溫5分鐘，剩餘酶活在90％以上，能夠滿足工業生產中高溫制粒的要求。並且通過高通量篩選，獲得高表達量的菌株，進一步滿足工業化生產降低成本的要求，因此，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的最佳化改良的植酸酶可在飼料工業中顯示出巨大的套用潛力。
附圖說明
圖1為pPICzαA-PHYTH酵母菌株在7升發酵罐中的發酵情況。
圖2為植酸酶APPA和PHYTH在不同pH值環境下的相對酶活曲線圖。
圖3為植酸酶APPA和PHYTH經不同溫度處理後的相對酶活曲線圖。
技術領域
《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》涉及基因工程領域，具體地，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》涉及一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用。
權利要求
1.一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH，其特徵在於，其胺基酸序列為SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。
2.一種最佳化改良的耐高溫植酸酶基因PHYTH，其特徵在於，編碼權利要求1所述的植酸酶。
3.如權利要求2所述的植酸酶基因PHYTH，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。
4.一種最佳化改良植酸酶APPA耐熱性的方法，其特徵在於，通過基因突變改變SEQIDNO.1所示的來源於大腸桿菌Escherichiacoli的植酸酶APPA的多個胺基酸，胺基酸突變位點為：SEQIDNO.1所示胺基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第259位用L替代I，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。
5.包含權利要求2或3所述的植酸酶基因的重組載體。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於，所述重組載體為pPICzαA-PHYTH，通過使用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切胺基酸序列為SEQIDNO.2所示蛋白質的編碼基因、並連線到pPICzaA載體EcoRI和NotI位點構建所述重組載體。
7.包含權利要求2或3所述的植酸酶基因的重組菌株。
8.一種表達權利要求1所述最佳化改良的植酸酶PHYTH的方法，其特徵在於，包括以下步驟：1）用權利要求6所述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2）重組菌株進行發酵，誘導重組植酸酶的表達；以及3）發酵結束後，回收並純化所表達的植酸酶PHYTH。
9.權利要求1所述的植酸酶PHYTH在飼料添加劑中的套用。
實施方式
操作內容
實驗材料和試劑：
1、菌株與載體
大腸桿菌菌株Top10、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA，Zeocin購自Invitrogen公司，載體pECO購自Gentarget公司。
2、酶與試劑盒
PCR酶，質粒提取，膠純化，限制性內切酶、試劑盒購自上海生工公司。
3、培養基
大腸桿菌培養基為LB（1％蛋白腖，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0）。LB-AMP為LB培養基加100微克/毫升氨苄青黴素。LB-Zeo為LB培養基加25微克/毫升Zeocin。
酵母培養基為YPD（1％酵母提取物，2％蛋白腖，2％葡萄糖）。酵母篩選培養基為YPDzeo（YPD+100毫克/升zeocin）。
酵母誘導培養基BMGY（I％酵母提取物、2％蛋白腖、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油（V/V））和BMMY（除以0.5％甲醇代替甘油，其餘成份相與BMGY相同）。
PTM1（微量鹽溶液）：硫酸銅0.6％、碘化鉀0.018％、一水硫酸錳0.3％、二水鉬酸鈉0.02％、硼酸0.002％、六水氯化鈷0.05％、氯化鋅2％、七水硫酸鐵6.5％、濃硫酸0.5％、生物素0.02％。
實施案例
實施例1 大腸桿菌植酸酶基因APPA的合成及克隆
以已公布（2010年11月前）的大腸桿菌來源的植酸酶基因APPA序列作為參考，套用生物軟體UPGENE，根據畢赤酵母最適密碼子人工合成該基因。
根據基因5’端設計PCR引物含有EcoRI內切酶位點，3’端設計PCR引物含NotI內切酶位點，起引物序列如下：
5’端引物PHYTH-F1：gtaGAATTCatgcaaagcgaacccgaattaaaattag
3’端引物PHYTH-R1：attGCGGCCGCttacagggaacaggcaggaatcctg
以合成基因為模板，用上述引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體pECO上，得到重組載體pECO-PHYTH。
實施例2 基因定點突變
對去除了信號肽的大腸桿菌植酸酶APPA進行蛋白結構自動建模分析（swissmodel），分析其二級結構和三級結構。APPA共有410個胺基酸殘基，其中共有20個a螺旋，其15-23個胺基酸殘基為酸性植酸酶所共有的保守序列：RAGVRAPT。該蛋白共有兩個結構域：N端的134個胺基酸殘基與C端的152的胺基酸殘基共同組成結構域1，其餘中間124胺基酸殘基組成結構域2，保守序列與活性中心均位於結構域1中。在不破壞其二級結構與活性中心的前提下，對活性中心附近以及二級結構連線處進行胺基酸定點突變。共預測了17個待突變位點，分別為：+7L，+45L，+70D，+77G，+112T，+133V，+150G，+159H，+210G，+238T，+2623E，+281T，+297S，+316E，+343S，+379T，+406I針對性的設計了17對飽和突變引物，目的基因突變位點統一為NNK，NNK左右各取15個鹼基構成正向引物；反向引物與正向引物完全互補，其中，N代表A，T，C，G等四種鹼基，K代表G，T等兩種鹼基。
PCR產物經DpnI酶切處理後轉化BL21感受態細胞，在LB-Amp平板篩選陽性突變重組克隆。通過定點突變PCR得到10個相關胺基酸位點突變的陽性克隆，突變位點為+45L，+70D，+133V，+159H，+238T，+262E，+281T，+296S，+316E，+379T突變成+45I，+70E，+133L，+159K，+238L，+262I，+281S，+296N，+316C，+379C。對陽性突變位點進行隨機重組得到最優組合，其含有8個突變位點，為+45L，+70D，+133V，+159H，+238T，+281T，+316E，+379T突變成+45I，+70E，+133L，+159K，+238L，+281S，+316C，+379C，該克隆命名為pECO-PHY-M8。
實施例3 基因易錯PCR隨機突變
以上述pECO-PHY-M8為模板，進行易錯PCR隨機突變擴增，具體地擴增方法是：
第一輪擴增：以載體啟動子引物T7-F和T7-R為引物進行PCR擴增，反應體系如下：
Buflcrlaq（10X） | 10微升 |
易錯dNTPs（2摩爾/升 dATP，2摩爾/升 dGTP.lO摩爾/升 dTTP，10摩爾/升 dCTP） | 10微升 |
引物1（T7-F,50微摩爾/升） | 1微升 |
引物2（T7-R,50微摩爾/升） | 1微升 |
PECO-PHYTH（20納克） | 1微升 |
MgCl2（25摩爾/升 ） | 22微升 |
MnSO4（12.5摩爾/升 ） | 4微升 |
Taq酶 | 1微升 |
加水至 | 100微升 |
反應程式如下：
94℃ | 2分鐘 | |
94℃ | 40秒 | 30循環 |
50℃ | 1分鐘 | |
72℃ | 1分鐘 | |
72℃ | 15分鐘 |
回收第一輪PCR產物，去1微升稀釋50-100倍用作第二輪PCR的模板；
第二，第三輪易錯PCR以植酸酶特異性引物PHYTH-F1及PHYTH-R1替代引物T7-F和T7-R為反應引物，重複PCR反應。
取第二、三輪的產物用NotI和EcoRI進行雙酶切，連線至pECO載體上的EcoRI和NotI位點之間。連線產物轉化BL21，在LB氨苄瓊脂糖平板培養篩選突變菌株。
實施例4、高通量耐溫性突變菌株篩選
從實施例3易錯PCR平板上挑取突變單菌落，接種到96孔深孔培養平板（即母板）。每個平板挑選16個未突變的克隆為對照。每孔含500微升培養基LB-Amp。37℃搖床200轉每分培養24小時後，轉移50微昇平台期生長菌液到新的96孔平板，平板每孔添加450微升LB-AMP培養基，含有終濃度為0.5摩爾/升 IPTG（即子板），37℃過夜搖床200轉每分誘導表達植酸酶。含有過夜培養誘導表達植酸酶的菌液平板在75℃水浴鍋加熱處理5分鐘後細胞裂解，檢測培養液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐熱活性檢測根據中華人民共和國國家標準《GB/T18634-2002》進行。
剩餘酶活反應結果超過對照克隆組的克隆挑選為陽性克隆。從母板上挑選陽性克隆集中到96孔平板重複上述的培養，誘導表達，熱處理篩選試驗。確定耐溫性能有所提高的陽性突變克隆，得到3個陽性克隆，取陽性克隆質粒DNA進行基因測序。
測序結果確定胺基酸陽性突變位點，克隆1的突變位點為+25A，+81S，+139A替換為+25H，+81T，+139S；克隆2的突變位點為+209T，+409S替換為+209S，+409C；克隆3的突變點為+139A，+318N替換為+139S，+318Q。結合定點突變和易錯PCR獲得了陽性克隆，為進一步提高植酸酶的耐溫性，進行了突變位點的重組篩選。以pECO-PHY-M8為模板，選用上述6個位點的定點突變引物，定點突變引物設計如上所述，通過定點突變PCR進行隨機組合擴增，PCR產物經DpnI酶切處理後轉化BL21感受態細胞，在LB-Amp平板篩選陽性突變重組克隆。挑取突變重組克隆菌落到96孔培養板培養，進行誘導表達，按上述方法進行熱處理篩選實驗。
通過剩餘植酸酶酶活性的測定，突變重組克隆經過98個平板的重複篩選，在約8000個重組菌落中篩選得到了最佳耐溫性突變克隆，經測序得到其基因序列，新加入了4個突變點，突變位點為+81S，+139A，+209T，+318N替換為+81T，+139S，+139S+318Q，較之原始人工合成基因，突變體共加入了共12個突變位點（突變位點由+45L，+70D，+81S，+133V，+139A，+159H，+209T，+238T，+281T，+316E，+318N，+379T突變成+45I，+70E，+81T，+133L，+139S，+159K，+209S，+238L，+281S，+316C，+318Q，+379C），該最佳耐溫性突變的植酸酶基因命名為PHYTH。
實施例5、植酸酶PHYTH酵母表達載體的構建及工程菌株的篩選
培養高通量熱處理篩選得到的耐熱植酸酶PECO-PHYTH大腸桿菌細胞，提取質粒DNA。限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切後純化含有PHYTH基因的DNA片段，連線到pPICzaA載體EcoRI和NotI位點，使植酸酶基因PHYTH插入到上述表達載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，通過載體與畢赤酵母染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩定整合到酵母染色體上。連線產物轉化TOP10大腸桿菌，LB-ZEO瓊脂糖平板培養獲得pPICzaA-PHYTH陽性菌落。
提取pPICzaA-PHYTH陽性菌落質粒，電擊轉化酵母X33感受態細胞，塗布含100微克/毫升Zeocin和含500微克/毫升Zeocin的YPDS固體培養平板，30℃培養2-3d。挑取在高濃度ZeocinYPDS平板（500微克/毫升）上生長速度及菌落大小與100微克/毫升ZeocinYPDS平板上相同的轉化子，有可能含高拷貝的外源基因，挑選這些轉化子進行進一步的表達實驗。
實施例6、植酸酶的活性測定
按照中華人民共和國國家標準《GB/T18634-2002》進行。植酸酶活性定義是指樣品在植酸鈉濃度為5.0毫摩爾/升、溫度37℃、pH值5.5的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1皮摩爾無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
U＝FxC/（Vx30）
式中：U-試樣中植酸酶的活性，U/毫升；C-根據實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性，U；F-試樣溶液反應前的總稀釋倍數；V-試樣體積，毫升；30-反應時間，分鐘。
磷濃度（毫摩爾/升） | 0 | 1.5625 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 |
OD值 | 0 | 0.054 | 0.109 | 0.212 | 0.437 | 0.942 |
實施例7、7升發酵罐小試
從YPD-zeo平板上選取單克隆，接種於20毫升BMGY培養基中，30℃、240轉每分培養20小時。以1:50的比例接種到300毫升BMGY培養基中，30℃、240轉每分培養至OD600＝5，用以接種發酵罐。
國產7升發酵罐，加入3升發酵基礎培養基，121℃滅菌20分鐘，調節溫度至30℃，用氨水調節pH至4.6，加入PTM1（4.35毫升/升），接入種子菌（1:10）。發酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在500-800轉每分之間以維持溶氧20％以上。
發酵分為三個階段：生長期，從加入種子菌，培養約16-24小時，直到將發酵罐中甘油耗盡，表現為溶氧突然上升；之後進入甘油促生長期，補加50％甘油（含有PTM1，12毫升/升），補料速度為18毫升/升·小時，持續4-6小時；最後進入誘導期，用氨水或磷酸調節pH至所需值，流加100％甲醇（含有PTM1，12毫升/升），流速從1毫升/升·小時經15小時線性升至4毫升/升·小時，持續120小時。
發酵過程中，每隔24小時取發酵液測定OD600以及菌體濕重，取上清液進行植酸酶活性檢測。發酵結束最終平均發酵酶活達到14300U/毫升，發酵過程曲線如圖1所示。
實施例8、對改良前大腸桿菌植酸酶APPA及改良後植酸酶PHYTH的性質分析
對改良前大腸桿菌植酸酶APPA和改良後植酸酶PHYTH分別進行最適pH的測定，測定方法按常規方法進行測定，結果如圖2所示，從圖2可見，改良前大腸桿菌植酸酶APPA和改良後植酸酶PHYTH的pH反應曲線沒有改變，最適pH值均為5.0。
根據國家植酸酶檢測方法稀釋植酸酶發酵液，在60-82℃區域進行耐溫性實驗。改良前大腸桿菌植酸酶APPA和改良後植酸酶PHYTH在PCR儀上不同溫度加熱處理5分鐘後迅速放入冰水降溫。另設一個未加熱對照組。按常規方法進行酶活測定，以未加熱處理樣品結果為100％，檢測各溫度熱處理5分鐘後剩餘酶活，如圖3所示。從圖3可見，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》的改良後植酸酶PHYTH在耐熱性能上有了很大的提高，75℃處理5分鐘，酶活仍保留90％以上，而突變前的植酸酶經75℃處理5分鐘，酶活保留不足原來的10％。經過突變篩選，獲得的植酸酶PHYTH耐溫性提高了11℃以上，實現了真正的耐高溫，完全可以滿足顆粒飼料制粒耐溫條件要求。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種最佳化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
