耐熱型β-木聚糖酶基因的異源高效表達及突變研究

《耐熱型β-木聚糖酶基因的異源高效表達及突變研究》是依託北京工商大學，由李秀婷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：耐熱型β-木聚糖酶基因的異源高效表達及突變研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李秀婷
• 依託單位：北京工商大學

項目摘要

突破絲狀真菌低轉化率、低外源蛋白合成效率及內源性蛋白酶的水解作用，獲得來源安全、產量高的耐熱木聚糖酶是破解我國傳統主食饅頭抗老化保鮮技術難題的關鍵科學問題之一。本課題擬採用DNA介導轉化系統的方法，構建並篩選獲得適合轉化米麴黴的強表達整合型載體來提高轉化效率，利用同源重組方法獲得蛋白酶基因缺失菌株，構建米麴黴高效表達耐熱β-木聚糖酶基因突變體的生物合成體系，以期獲得高效表達的適合食品工業生產的高安全性絲狀真菌表達系統；為揭示米麴黴菌體異源β-木聚糖酶合成控制規律，利用米麴黴作為異源蛋白質合成生物平台提供理論依據；實現高活性耐熱木聚糖酶的安全高效表達，獲得適用於中國傳統主食饅頭加工過程的產量高、安全性好的特異性酶。本項目不僅能夠為絲狀真菌高效表達異源蛋白的相關理論提供參考，也能為解決饅頭老化問題、提高其品質提供有效方法和基礎數據，為推進饅頭生產的工業化進程奠定科學基礎。

結題摘要

項目研究團隊完成教酒鏈黴菌L1105木聚糖酶基因xynA的生物信息學分析，基因表達，酶結構分析，性質研究等工作。利用易錯PCR體外分子定向進化技術對枝鏈黴菌L2001木聚糖酶及教酒鏈黴菌L1105木聚糖酶進行分子改良，獲得特異性增強的穩定突變體，並探究了中國傳統發酵麵製品中的套用特點，以利於該酶的進一步工業化生產套用。 項目著重研究了教酒鏈黴菌L1105木聚糖酶分子碳端結構域，探索含CTD的多區域木聚糖酶結構中非催化結構對催化功能的影響機制，釐清了木聚糖酶多區域結構中非催化的CTD結構的作用，為構建高效表達耐熱β-木聚糖酶基因突變體的生物合成體系奠定基礎。採用高效定向技術及宏基因組學技術對木聚糖酶資源進行進一步的發掘，獲得了一株來源新穎的放線菌菌株L10608及非培養的木聚糖酶新基因xynA1-19，為構建高效表達的適合食品工業生產的高安全性絲狀真菌表達系統提供新木聚糖酶基因資源。 項目團隊從生產套用對木聚糖酶需要出發，結合實驗室已篩選的產木聚糖酶的基因資源，運用基因工程及蛋白質工程技術等手段，系統開展了耐熱、耐酸及非培養的β-木聚糖酶基因的克隆、表達、突變及蛋白質分子改造、異源蛋白高效表達的基本變化規律等研究工作。從酶水解特異性及酸性木聚糖酶耐熱性的角度，針對多樣化的研究材料編碼木聚糖酶基因序列，對嗜熱踝節菌F1208、婁徹氏鏈黴菌L10904及微紫青黴MA21601重組木聚糖酶等進行分子改造，探討：（1）木聚糖酶N端及C端改造對其水解特性改善的分子機制；（2）微紫青黴酸性木聚糖酶XynA基因的克隆與序列分析；（3）木聚糖酶催化特異性產物生成機制。 本項目成果對於豐富我國木聚糖酶資源，實現高活性耐熱木聚糖酶的安全高效表達，獲得更多極具特色的適用於中國傳統主食饅頭加工過程的產量高、安全性好的特異性優良木聚糖酶提供了技術支撐，也為解決中國傳統發酵麵製品等老化問題、提高其品質提供基礎數據。 至項目結題，已撰寫並發表究論文33篇，其中SCI收錄11篇；EI收錄3篇，核心期刊論文17篇；申請國家發明專利6項，其中獲授權專利2項；獲省部級以上科技獎勵6項；碩士畢業論文9篇。