《木聚糖生物合成中的關鍵科學問題研究》是依託華南農業大學，由吳藹民擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：木聚糖生物合成中的關鍵科學問題研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：吳藹民
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
木聚糖是微管束中次生加厚的主要成分之一，但木聚糖合成的分子機理仍不明確，目前仍然沒有相關酶與底物反應的直接證據。本研究從擬南芥中克隆與木聚糖合成相關的多個基因， 利用酵母雙雜交、BiFC（分離的YFP）以及免疫共沉澱技術來證明這些蛋白產物間的相互作用；同時在酵母內表達純化這些蛋白或構建融合表達載體，轉化各自的突變體，在恢復功能的突變體中純化融合蛋白；在此基礎上對純化蛋白進行兩兩混合或3-4成分混合，然後測定其木糖轉移酶活性，並比較主效基因酶複合體和次效基因酶複合體活性間的差異。對參與木聚糖合成的關鍵基因進行定位及功能比較，明確內質網和高爾基體在木聚糖合成中的作用。製備主要基因蛋白抗體，利用抗體驗證基因的定位。對擬南芥中的木聚糖合成的模式推廣，分析比較木材的同源基因。本研究將幫助我們進一步明確木聚糖合成及調控的分子機理，為木材的分子改良及調控提供理論和技術基礎。
結題摘要
木聚糖在植物次生生長和能量積累方面起重要作用，其合成及利用研究則是近來植物學的熱點問題。本項目首先從擬南芥中克隆了木聚糖合成關鍵酶的多個基因，定位研究表明IRX10、IRX10-L、IRX14、IRX14-L 是高爾基體和內質網共同表達的，FRA8 和F8H 只在高爾基體表達，而IRX9 和IRX9-L主要在內質網表達。利用BiFC以及免疫共沉澱技術來證明了這些蛋白產物間的相互作用，並且蛋白可以形成同源或異源二聚糖，再形成高聚體；GT47家族中的IRX10和FRA8結構差異在於IRX10的N端是信號肽，而FRA8蛋白是跨膜區，且Western雜交證明了IRX10的N端信號肽可以切除。對IRX10和FRA8蛋白中的保守extosin 功能域進行交換，新蛋白能互補各自的突變體，因而從進化的角度上，功能域在功能上還是保守的。接著，我們建立了一種準確快速測定木糖轉移酶活性的方法，利用從植物中提取的微囊體蛋白以尿苷二磷酸木糖（UDP-Xyl）和含螢光基團的低聚木糖（Xyln-AA）為底物進行加成反應，高效液相色譜（HPLC）檢測產物，結果表明XylT可以將多至5個UDP-Xyl轉移到受體上，上部微囊體XylT活性最小而下部最大，XylT活性隨底物聚合度增大而增強。酶切結果證明了加成產物可以被木聚糖酶酶切，核磁分析產物間分子量大小差異剛好是32，符合木糖失去一個水的分子量，充分證明了產物是木聚糖加成反應的產物。進一步，還原膠實驗表明IRX9、IRX10和IRX14的抗體均會產生一條分子量約在480KD的條帶，說明它們可能形成分子量相同複合體。雷射共聚焦實驗表明：IRX9單獨表達時，IRX9更傾向於內質網表達，IRX9與IRX14共表達時也是如此，只有當IRX9與IRX10和IRX14共表達時，更傾向於高爾基體表達。體外過表達酶活性測定表明，IRX10單獨表達有低酶活性，而當IRX9與IRX14單獨表達時沒有活性，IRX9和IRX14共表達時也沒有活性，IRX10與IRX9及IRX10與IRX14兩兩共表達時有少量活性，而只有當IRX10與IRX9、IRX14三者共表達時才有高酶活性，進一步證明了三者之間可以形成複合體。此外，我們還對木聚糖合成酶調控及底物進行了研究。本項目目前已經發表三篇SCI文章、兩篇核心文章，申請了三個專利，其中一項已經授權，目前還有多篇SCI論文在投稿。
