《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》是中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院於2013年6月9日申請的專利，該專利的公布號為CN103409468A，公布日為2013年11月27日，發明人是李鵬、劉志新、蔣志武、王素娜、尹愛蘭、鐘梅、賈蓓。
《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》包括如下步驟：（1）構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；（2）步驟（1）構建出的DNA純化後經逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；（3）mRNA純化並凍存於RNAase free的超純水中；（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，收集受精卵；（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內；（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；（8）建立穩定的缺陷小鼠品系。該發明的優點，能夠得到完全對異體移植無免疫排斥作用的小鼠模型用於試驗。
2017年12月11日，《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法
- 申請人：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
- 申請日：2013年6月9日
- 申請號：2013102296299
- 公布號：CN103409468A
- 公布日：2013年11月27日
- 發明人：李鵬、劉志新、蔣志武、王素娜、尹愛蘭、鐘梅、賈蓓
- 地址：廣東省廣州市蘿崗區科學城開源大道190號
- 分類號：C12N15/89(2006.01)I、A01K67/027(2006.01)I
- 代理機構：北京東正專利代理事務所
- 代理人：蔡仲德
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
2013年前，常用作免疫缺陷小鼠模型的品種有Rag1基因敲除小鼠、NOD/SCID小鼠、Rag2基因敲除小鼠。衡量機體免疫缺陷的程度，主要是測量機體內T、B淋巴細胞、NK細胞所占的比例。Rag基因敲除小鼠不能在體內產生成熟的T、B淋巴細胞，但可以產生正常水平的NK細胞，對異體移植物還是具有一定的免疫排斥作用；NOD/SCID小鼠缺少發育成熟的T、B淋巴細胞，NK細胞的活性也較低。相對於Rag小鼠而言，NOD/SCID小鼠對異體移植物免疫排斥較低，對於這些小鼠還需作出進一步的人工化的處理，使之成為完全對異體移植無影響的、符合試驗指標的小鼠。在2013年6月之前的方法中，美國的傑克遜實驗室（The Jackson Laboratory）和日本的實驗動物研究中心（Central Institutefor Experimental Animals，CIEA）都是將NOD/SCID小鼠和敲除IL2rg基因的小鼠進行交配，再經過遺傳篩選的辦法得到缺少成熟T、B和NK細胞的免疫缺陷小鼠，並分別命名為NSG小鼠和NOG小鼠。但是利用此種方法建立免疫缺陷小鼠品系需要兩年的時間，存在周期漫長、品系背景不純等缺陷。而且，美國和日本為了對中國進行技術封鎖，至今不肯向中國市場出售NSG和NOG小鼠，給中國科研事業的發展製造障礙。
發明內容
專利目的
為了解決2013年6月之前的技術中建立免疫缺陷小鼠品系周期漫長、品系背景不純的技術缺陷，以及衝破美國、日本對中國的技術封鎖，該發明公開了一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法，使中國得到符合試驗指標、品系背景更純的免疫缺陷小鼠模型，同時縮短了得到免疫缺陷小鼠的時間，通過該發明建立的免疫缺陷小鼠是一種良好的人源化小鼠的載體。通過向該發明建立的免疫缺陷小鼠體內移植人CD34+造血幹細胞，小鼠模型無排斥人體組織的反應，可以建立造血系統人源化小鼠模型。該發明所建立的免疫缺陷小鼠可以套用於腫瘤生物學，人源化抗體製造，HIV等研究領域。
技術方案
《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》包括如下步驟：
（1）利用TEALN基因敲除術，構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；
（2）將步驟（1）構建出的DNA純化，純化後使用SP6逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；
（3）將步驟（2）得到的mRNA純化，並凍存於RNAasefree的超純水中，以備顯微注射之用；
（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；
（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用質量濃度為0.9％的生理鹽水清洗後，放在顯微鏡下觀察，挑取並收集受精卵；
（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內，受精卵將mRNA翻譯成蛋白，蛋白結合到免疫相關基因，從而使免疫相關基因的功能喪失。
（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；
（8）將步驟（7）獲得的免疫缺陷小鼠自交，擴大種群數量，建立穩定的缺陷小鼠品系。
所述的小鼠為Rag1基因敲除小鼠、NOD/SCID小鼠或Rag2基因敲除小鼠。所述的免疫相關基因為IL2rg基因。所述步驟（1）的操作步驟為：
①利用TELANTargeter軟體對免疫相關基因序列分析，從小鼠細胞中的免疫相關基因序列中選擇合適做敲除的基因位點為AGATCCTTCTTAGTCCTTCAGCTGCTCCTGCTGAGGGCAGGGTGGAGCTCC
②步驟①中的基因位點中，從首端鹼基A開始的基因片段AGATCCTTCTTAG即為L，尾端的基因片段AGGCAGGGTGGAGCTCC即為R，剩餘中間部分的基因片段即為M，分別編碼與L、R結合的DNA。構建的DNA所編譯的蛋白與L和R結合，破壞M序列。
所述步驟（4）中的受孕雌鼠的獲得方法是將雌鼠注射激素後，與相同品種的雄鼠發生交配行為，發生交配行為後的雌鼠即為受孕雌鼠。向雌鼠注射激素的方法是，向性成熟的雌鼠注射孕馬血清促性腺激素，48小時後，再注射人絨毛膜促性腺激素，即可得到注射激素的雌鼠。所述步驟（4）中假孕雌鼠的獲得方法是，雌鼠與同一品種結紮處理過的雄鼠發生交配行為後，即為假孕雌鼠。
有益效果
《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》的有益效果：該發明方法中構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA時，經過了大量試驗，選擇出了合適的免疫相關基因敲除位點，能夠得到完全對異體移植無免疫作用的小鼠模型用於試驗，而且建立小鼠模型的周期由現在的兩年時間縮短到兩個月，使NOD/SCID小鼠、RAG基因敲除小鼠的T、B、NK淋巴細胞比例更少，進一步得到免疫缺陷程度高的小鼠。此種小鼠用作腫瘤藥物篩選、治療疾病機理的試驗時，異體移植成功率高，是一種理想的人源化小鼠載體，並且，小鼠品系背景更加純淨，例如母代是NOD/SCID小鼠，其進一步免疫缺陷的小鼠品系也是穩定的NOD/SCID小鼠。
附圖說明
圖1為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、NOD/SCID小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（NSI）的T細胞儀器譜圖；
圖2為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、NOD/SCID小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（NSI）的B細胞儀器譜圖；
圖3為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、NOD/SCID小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（NSI）的NK細胞儀器譜圖；
圖4為使用該發明方法獲得的免疫缺陷NSI小鼠在移植臍帶血造血幹細胞後，注射造血幹細胞的NSI小鼠和實驗組移植造血幹細胞4周之後的NSI小鼠骨髓中人源細胞比例的對比圖譜。
圖5為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag1小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag1IL2）的T細胞儀器譜圖；
圖6為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag1小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag1IL2）的B細胞儀器譜圖；
圖7為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag1小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag1IL2）的NK細胞儀器譜圖；
圖8為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag2小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag2IL2）的T細胞儀器譜圖；
圖9為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag2小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag2IL2）的B細胞儀器譜圖；
圖10為利用流式細胞技術測量出的正常野生小鼠（WT）、Rag2小鼠、通過該發明方法建立出的小鼠模型（Rag2IL2）的NK細胞儀器譜圖
圖11為對免疫相關基因IL2rg的基因敲除位點中可以識別序列L的DNA構建載體成功的示意圖；
圖12為對免疫相關基因IL2rg的基因敲除位點中可以識別序列R的DNA構建載體成功的示意圖；
權利要求
1.《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》其特徵在於，該方法包括如下步驟：（1）利用TEALN基因敲除術，構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；
（2）將步驟（1）構建出的DNA純化，純化後使用SP6逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；
（3）將步驟（2）得到的mRNA純化，並凍存於RNAasefree的超純水中，以備顯微注射之用；
（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；
（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用質量濃度為0.9％的生理鹽水清洗後，放在顯微鏡下觀察，挑取並收集受精卵；
（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內，受精卵將mRNA翻譯成蛋白，蛋白結合到免疫相關基因，破壞免疫相關基因序列，從而使免疫相關基因的功能喪失。
（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；
（8）將步驟（7）獲得的免疫缺陷小鼠自交，擴大種群數量，建立穩定的缺陷小鼠品系。
2.根據權利要求1所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述的小鼠為Rag1基因敲除小鼠、Rag2基因敲除小鼠或NOD/SCID小鼠。
3.根據權利要求1所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述的免疫相關基因為IL2rg基因。
4.根據權利要求1所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述步驟（1）的操作步驟為：①利用TELANTargeter軟體對免疫相關基因序列分析，從小鼠細胞中的免疫相關基因序列中選擇合適做敲除的基因位點為AGATCCTTCTTAGTCCTTCAGCTGCTCCTGCTGAGGGCAGGGTGGAGCTCC。②步驟①中的基因位點中，從首端鹼基A開始的基因片段AGATCCTTCTTAG即為L，尾端的基因片段AGGCAGGGTGGAGCTCC即為R，剩餘中間部分的基因片段即為M，構建的DNA所編譯的蛋白與L和R結合，破壞M序列。
5.根據權利要求1所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述步驟（4）中的受孕雌鼠的獲得方法是將雌鼠注射激素後，與相同品種的雄鼠發生交配行為，發生交配行為後的雌鼠即為受孕雌鼠。
6.根據權利要求5所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，向雌鼠注射激素的方法是，向性成熟的雌鼠注射100u/毫升孕馬血清促性腺激素75微升，48小時後，再注射100u/毫升人絨毛膜促性腺激素75微升，即可得到注射激素的雌鼠。
7.根據權利要求1所述的免疫缺陷小鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述步驟（4）中假孕雌鼠的獲得方法是，雌鼠與同一品種結紮處理過的雄鼠發生交配行為後，即為假孕雌鼠。
實施方式
以下結合具體實施例對《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》內容作出進一步的說明，以下實施例中所用到的NOD/SCID小鼠，Rag1基因缺陷小鼠，Rag2基因缺陷小鼠均為商品化的小鼠模型，可以從Jackson公司（TheJacksonLaboratory）購買。。
實施例一
利用該發明的方法對NOD/SCID品種小鼠作出進一步的免疫相關基因敲除，構建免疫缺陷小鼠模型用於篩選腫瘤藥物和治療疾病試驗，該方法包括以下步驟：（1）利用TEALN基因敲除術，構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；
（2）將步驟（1）構建出的DNA純化，純化後使用SP6逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；
（3）將步驟（2）得到的mRNA純化，並凍存於RNAasefree的超純水中，以備顯微注射之用；
（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；
（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用質量濃度為0.9％的生理鹽水清洗後，放在顯微鏡下觀察，挑取並收集受精卵；
（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內，受精卵將mRNA翻譯成蛋白，蛋白結合到免疫基因，破壞免疫相關基因序列，從而使免疫基因的功能喪失。
（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；
（8）將步驟（7）獲得的免疫缺陷小鼠自交，擴大種群數量，建立穩定的缺陷小鼠品系。
所述的免疫相關基因為IL2rg基因。所述步驟（1）的操作步驟為：
①利用TELANTargeter軟體對免疫相關基因序列分析，從小鼠細胞中的免疫相關基因序列中選擇合適做敲除的基因位點為AGATCCTTCTTAGTCCTTCAGCTGCTCCTGCTGAGGGCAGGGTGGAGCTCC
②步驟①中的基因位點中，從首端鹼基A開始的基因片段AGATCCTTCTTAG即為L，尾端的基因片段AGGCAGGGTGGAGCTCC即為R，剩餘中間部分的基因片段即為M。構建成功的能夠識別L序列的DNA載體見圖11，其序列在DNA序列表中第1條DNA序列，與之相對應的轉錄成的mRNA見第2條DNA序列，構建成功的能夠識別R序列的DNA載體見圖12，其序列在DNA序列表的第3條DNA序列，與之相對應的轉錄成mRNA序列見第4條DNA序列。
上述步驟選擇合適的敲除基因位點時，根據IL2rg基因序列，在DNA序列表中第5條DNA序列選擇某一位點，無限次的重複該發明方法，最終得到的小鼠，測量小鼠體細胞中T、B、NK細胞的比例，才確定出的最佳敲除基因位點。
步驟（2）中DNA純化的步驟如下：
1、50微升的酶切產物加入85微升的超純水，和15微升的3M醋酸鈉溶液，充分混勻.
2、加入等體積的苯酚/氯仿混合物（1:1比例）抽提後再用等體積氯仿抽提兩次。收集水相轉移至新離心管。
3、加入2倍體積乙醇沉澱DNA，-20攝氏度靜置30分鐘後離心收集沉澱。
4、棄上清，50微升70％冰乙醇漂洗沉澱。
5、加入20微升超純水重溶DNA。
6、紫外分光光度計測定DNA濃度。
7、DNA凍存於-20攝氏度備用。
步驟（3）中mRNA純化的步驟為：
1、50微升的轉錄產物加入85微升的RNasefree水，和15微升的3M醋酸鈉溶液，充分混勻.
2、加入等體積的苯酚/氯仿混合物（1:1比例）抽提後再用等體積氯仿抽提兩次。收集水相轉移至新離心管。
3、加入2倍體積乙醇沉澱mRNA，-20攝氏度靜置30分鐘後離心收集沉澱。
4、棄上清，50u170％冰乙醇漂洗沉澱。
5、加入20u1RNasefree水重溶mRNA。
6、紫外分光光度計測定RNA濃度。
7、mRNA凍存於-20攝氏度備用。
所述步驟（4）中的受孕雌鼠的獲得方法是將雌鼠注射激素後，與相同品種的雄鼠發生交配行為，發生交配行為後的雌鼠即為受孕雌鼠。向雌鼠注射激素的方法是，向性成熟的雌鼠注射100U/毫升孕馬血清促性腺激素75微升，48小時後，再注射100U/毫升人絨毛膜促性腺激素75微升，即可得到注射激素的雌鼠。所用到的孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素均是商業化成品，購自於prospec-tany公司。
所述步驟（4）中假孕雌鼠的獲得方法是，雌鼠與同一品種結紮處理過的雄鼠發生交配行為後，即為假孕雌鼠。套用該發明方法得到免疫缺陷小鼠，利用PCR和DNA測序技術檢驗免疫缺陷小鼠體細胞中的IL2rg基因是否被成功突變，被成功突變的IL2rg基因序列見DNA序列表，由DNA序列表第6條DNA序列可知，由於DNA序列的移碼突變，IL2rg基因功能已喪失。
使用流式細胞計數測量野生小鼠、NOD/SCID小鼠、該發明的免疫缺陷小鼠即NSI小鼠外周血中的相關免疫細胞比例，證明通過該發明建立的方法，所獲得的NSI小鼠確實為進一步免疫缺陷小鼠，具體步驟如下：
一、試驗涉及到的儀器及試劑材料：B220-PERCP，NKp46-PE和CD3-APC流式抗體為ebioscience公司產品。流式細胞儀BDAccuriC6為BD公司產品。紅細胞裂解液為BD公司產品。野生小鼠、NOD/SCID小鼠、NSI小鼠的飼養和繁育於中科院廣州生物醫藥與健康研究院實驗動物中心（SPF級）完成。
二、野生小鼠、NOD/SCID小鼠、NSI小鼠斷尾取血，約200微升。使用BD公司的紅細胞裂解液裂解紅細胞後，300g離心10分鐘，獲取血液中的白細胞。將每份白細胞分為5等份，取其中的4份分別於如下流式抗體中4攝氏度孵育30分鐘：B220-PERCP，NKp46-PE，CD3-APC，NKp46-PE+CD3-APC。流式抗體的用量和使用方法可以參考產品說明書。孵育完成後，PBS清洗一遍，重懸於200微升的PBS中，上機檢測。
三、下述表格為按照上述方法建立的野生小鼠、NOD/SCID小鼠、NSI小鼠細胞中的的T、NK和B淋巴細胞的流失細胞數據比較。
野生型小鼠 （WT） | NOD/SCID小鼠 | NSI小鼠 | |
B細胞 | 12.2% | 2.0% | 0.4% |
總T細胞 | 15.2% | 2.9% | 1.7% |
CD4+T細胞 | 5.1% | 0.1% | 0.1% |
CD8+細胞 | 10.7% | 2.9% | 1.7% |
NK細胞 | 2.0% | 9.6% | 0.3% |
由上表可看出與正常野生型小鼠相比，NSI免疫缺陷小鼠缺少發育成熟的T、NK和B淋巴細胞，主要表現為流式細胞技術檢測到表達CD3，NKp46和B220表面分子的淋巴細胞很少，不足以對異體移植物產生免疫排斥反應。與NOD-SCID小鼠相比，NSI免疫缺陷小鼠缺少發育成熟的NK淋巴細胞。三種小鼠利用流式細胞測量出的T、B、NK細胞比例見圖1、圖2、圖3。
使用該發明方法獲得的免疫缺陷NSI小鼠在移植臍帶血造血幹細胞後可以在小鼠體內重建人類造血系統的試驗：
一、試驗中所用試劑材料及其來源包括：
臍帶血由廣州臍帶血幹細胞庫提供。流式抗體CD34-APC和CD38-PE為Biolengend產品。DiamondCD34IsolationKit為MACS公司產品。Lymphoprep淋巴細胞分離液為Axis-shield公司產品。
二、試驗步驟：臍帶血使用生理鹽水1:1稀釋之後，使用Lymphoprep淋巴細胞分離液分離白細胞，隨後對分離到的細胞進行計數。使用DiamondCD34IsolationKit分離白細胞中的CD34細胞。取0.5X10個造血幹細胞，通過尾靜脈注射入NSI小鼠體內。
如圖4所示，對照組為未注射造血幹細胞的NSI小鼠，實驗組為移植造血幹細胞4周之後的NSI小鼠。流式數據顯示，通過注射臍帶血造血幹細胞，可以在小鼠骨髓中檢測到表達人體白細胞表面分子標記（CD45）的造血細胞。在CD45陽性的細胞中，可以檢測到CD34陽性的造血幹細胞。試驗結果證明，通過移植造血幹細胞，可以在NSI小鼠體內成功重建人類造血系統。
實施例二
利用該發明的方法對Rag1基因敲除小鼠作出進一步的免疫缺陷小鼠模型用於篩選腫瘤藥物和治療疾病試驗，該方法包括以下步驟：（1）利用TEALN基因敲除術，構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；
（2）將步驟（1）構建出的DNA純化，純化後使用SP6逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；
（3）將步驟（2）得到的mRNA純化，並凍存於RNAasefree的超純水中，以備顯微注射之用；
（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；
（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用質量濃度為0.9％的生理鹽水清洗後，放在顯微鏡下觀察，挑取並收集受精卵；
（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內，受精卵將mRNA翻譯成蛋白，蛋白結合到免疫相關基因的敲除位點，破壞免疫相關基因的序列，從而使免疫相關基因的功能喪失。
（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；
（8）將步驟（7）獲得的免疫缺陷小鼠自交，擴大種群數量，建立穩定的免疫缺陷小鼠品系。
所述的免疫相關基因為IL2rg基因。所述步驟（1）的操作步驟為：
①利用TELANTargeter軟體對免疫相關基因序列分析，從小鼠細胞中的免疫相關基因序列中選擇合適做敲除的基因位點為AGATCCTTCTTAGTCCTTCAGCTGCTCCTGCTGAGGGCAGGGTGGAGCTCC
②步驟①中的基因位點中，從首端鹼基A開始的基因片段AGATCCTTCTTAG即為L，尾端的基因片段AGGCAGGGTGGAGCTCC即為R，剩餘中間部分的基因片段即為M。構建能夠編碼與L和R結合蛋白的DNA序列。
上述步驟選擇合適的敲除基因位點時，根據IL2rg基因序列，選擇某一位點，無限次的重複該發明方法，最終得到的小鼠，測量小鼠體細胞中T、B、NK細胞的比例，才確定出的最佳敲除基因位點。對RAG1小鼠作進一步的免疫缺陷如圖5-7所示
所述步驟（4）中的受孕雌鼠的獲得方法是將雌鼠注射激素後，與相同品種的雄鼠發生交配行為，發生交配行為後的雌鼠即為受孕雌鼠。向雌鼠注射激素的方法是，向性成熟的雌鼠注射100U/毫升孕馬血清促性腺激素75微升，48小時後，再注射100U/毫升人絨毛膜促性腺激素75微升，即可得到注射激素的雌鼠。所用到的孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素均是商業化成品，購自於prospec-tany公司。
所述步驟（4）中假孕雌鼠的獲得方法是，雌鼠與同一品種結紮處理過的雄鼠發生交配行為後，即為假孕雌鼠。
實施例三：利用該發明的方法對Rag2基因敲除小鼠作出進一步的免疫缺陷小鼠模型用於篩選腫瘤藥物和治療疾病試驗，該方法包括以下步驟：（1）利用TEALN基因敲除術，構建使小鼠細胞中免疫相關基因功能喪失的DNA；
（2）將步驟（1）構建出的DNA純化，純化後使用SP6逆轉錄酶經體外轉錄為mRNA；
（3）將步驟（2）得到的mRNA純化，並凍存於RNAasefree的超純水中，以備顯微注射之用；
（4）在SPF級別飼養條件下，飼養受孕雌鼠和假孕雌鼠；
（5）從步驟（4）的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用質量濃度為0.9％的生理鹽水清洗後，放在顯微鏡下觀察，挑取並收集受精卵；
（6）用顯微注射法將步驟（3）獲得的mRNA注射進步驟（5）得到的受精卵的原核內，受精卵將mRNA翻譯成蛋白，蛋白結合到免疫相關基因的敲除位點，破壞免疫相關基因的序列，從而使免疫相關基因的功能喪失。
（7）將步驟（6）獲得的受精卵移植入步驟（4）獲得的假孕雌鼠體內，假孕雌鼠開始培育第二代；
（8）將步驟（7）獲得的免疫缺陷小鼠自交，擴大種群數量，建立穩定的免疫缺陷小鼠品系。
所述的免疫相關基因為IL2rg基因。所述步驟（1）的操作步驟為：
①利用TELANTargeter軟體對免疫相關基因序列分析，從小鼠細胞中的免疫相關基因序列中選擇合適做敲除的基因位點為AGATCCTTCTTAGTCCTTCAGCTGCTCCTGCTGAGGGCAGGGTGGAGCTCC
②步驟①中的基因位點中，從首端鹼基A開始的基因片段AGATCCTTCTTAG即為L，尾端的基因片段AGGCAGGGTGGAGCTCC即為R，剩餘中間部分的基因片段即為M。構建能夠編碼與L和R結合蛋白的DNA序列。
上述步驟選擇合適的敲除基因位點時，根據IL2rg基因序列，選擇某一位點，無限次的重複該發明方法，最終得到的小鼠，測量小鼠體細胞中T、B、NK細胞的比例，才確定出的最佳敲除基因位點。所述步驟（4）中的受孕雌鼠的獲得方法是將雌鼠注射激素後，與相同品種的雄鼠發生交配行為，發生交配行為後的雌鼠即為受孕雌鼠。
向雌鼠注射激素的方法是，向性成熟的雌鼠注射100U/毫升孕馬血清促性腺激素75微升，48小時後，再注射100U/毫升人絨毛膜促性腺激素75微升，即可得到注射激素的雌鼠。所用到的孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素均是商業化成品，購自於prospec-tany公司。所述步驟（4）中假孕雌鼠的獲得方法是，雌鼠與同一品種結紮處理過的雄鼠發生交配行為後，即為假孕雌鼠。對RAG2小鼠作進一步的免疫缺陷如圖8-10所示。
榮譽表彰
2017年12月11日，《一種免疫缺陷小鼠模型的建立方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
