《基於CRISPR/Cas9基因組定點編輯技術的成年小鼠肝癌模型建立》是依託北京大學，由陳香梅擔任負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於CRISPR/Cas9基因組定點編輯技術的成年小鼠肝癌模型建立
- 項目負責人：陳香梅
- 依託單位：北京大學
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
肝細胞癌是我國常見的惡性腫瘤。肝癌動物模型是肝癌基礎和臨床研究的重要材料，但目前尚無滿足理想動物模型標準的小鼠肝癌模型。如何利用更高效的基因編輯技術，模擬肝癌由多個驅動突變促發的真實情況，建立與人原發性肝癌病因相似、表型特徵一致、簡單易行的小鼠模型是肝癌動物模型未來研究的熱點之一。我國肝癌多與B肝病毒（HBV）感染有關。我們的前期研究和文獻報導顯示，HBV在hTERT、MLL4和CCNE1基因的高頻整合、MLL4基因易位突變以及多基因聯合突變可能是促發我國肝癌發生的重要因素。本研究擬採用CRISPR/Cas9系統和水壓動力注射法，直接對成年野生型或HBV轉基因小鼠肝細胞進行多基因聯合編輯，模擬人肝癌發生的HBV整合、MLL4易位以及P53/Hnf-4α/Rae-1聯合突變等誘因，探索在一代小鼠內建立多基因聯合修飾肝癌模型的方法，為肝癌發病機制研究、臨床治療和藥物研發提供理想的實驗動物模型。
結題摘要
肝細胞癌是我國常見的惡性腫瘤。肝癌動物模型是肝癌基礎和臨床研究的重要材料，但由於肝癌的病因複雜，目前尚無滿足理想動物模型標準的小鼠肝癌模型。如何利用更高效的基因編輯技術，模擬肝癌由多個驅動突變促發的真實情況，建立與原發性肝癌病因相似、表型特徵一致、簡單易行的小鼠模型是肝癌動物模型未來研究的熱點之一。本課題旨在探索一種基於尾靜脈水壓動力注射和CRISPR/Cas9系統的快速簡便的小鼠肝癌模型建立方法。我國肝癌多與B肝病毒（HBV）感染有關，P53基因突變和PTEN基因失活是B肝相關肝癌中常見的兩種遺傳事件。本課題通過水壓動力注射技術將靶向小鼠肝細胞的p53與Pten基因的CRISPR/Cas9系統遞送至HBV轉基因小鼠的肝細胞，並觀察小鼠肝癌的發生情況。結果表明，HBV轉基因小鼠在sg-p53/Pten雙表達質粒尾靜脈水壓動力注射4個月後即可形成明顯肝腫瘤，而野生型小鼠則在10個月時才出現較小可見腫瘤。進一步分析發現，sg-p53/Pten質粒注射6個月和8個月的HBV轉基因小鼠的肝重體重比明顯高於對照組。免疫組化檢測結果顯示此方法誘導的腫瘤組織中存在明顯的谷氨醯胺合成酶異常表達以及p53和Pten表達降低，且肝細胞中脂肪堆積明顯。PCR聯合測序實驗證實在所檢測的腫瘤結節中均有p53和Pten基因突變，提示腫瘤的發生是由於p53和Pten基因突變引起的。進一步對腫瘤組織進行RNA-Seq分析結果顯示，我們構建的小鼠肝癌模型與人肝細胞癌的轉錄譜非常相似，尤其是與PTEN失活的人肝癌組織轉錄譜具有高度相似性。此外，我們還探討了Ubxn8與Pten、Cxcl2與p53 / Pten等多基因的聯合敲除，以及HBV整合小鼠肝癌模型的建立。總之，本研究建立的小鼠肝癌模型與我國肝癌發生病因相似，簡單經濟，且在一代小鼠內即可完成，將為我國肝癌的發病機制研究、臨床治療和藥物研發提供理想的實驗動物模型。
