《Nek2調控β-catenin促進肝癌轉移的分子機制研究》是依託浙江大學，由馮依力擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：Nek2調控β-catenin促進肝癌轉移的分子機制研究
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：馮依力
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
Wnt/β-catenin信號通路與肝癌的發展密切相關，β-catenin作為一個主要的效應分子，既能參與形成細胞間緊密連線的主要結構，又能入核調控靶基因的表達。β-catenin與惡性腫瘤的發生髮展密切相關，對該分子功能的調控必將對腫瘤的轉移產生非常大的影響。Nek2激酶可以磷酸化底物β-catenin，但是Nek2介導的β-catenin磷酸化所產生的生理效應至今未有研究。初步研究顯示：敲減內源Nek2明顯減弱細胞的遷移能力，同時我們在高轉移性的肝癌細胞系中檢測到Nek2的高表達。基於此，課題組將首次研究Nek2介導的β-catenin磷酸化在腫瘤轉移中發揮的作用。我們將利用生物學手段找到β-catenin磷酸化位點，並研究Nek2介導的β-catenin磷酸化產生的生理效應。在此基礎上，課題組結合臨床數據，揭示Nek2在腫瘤轉移過程中的作用，為腫瘤的防治提供理論依據。
結題摘要
肝癌（HCC）是世界範圍內最常見的惡性腫瘤之一，將近一半的肝癌病例都發生在中國，Wnt/β-catenin信號通路是近年來腫瘤生物學領域研究的熱點，也是肝癌發生過程中一條重要的信號通路。本項目原定揭示磷酸激酶Nek2對β-catenin的調控機制以及在肝癌發生過程中的作用，而在項目剛剛獲批時，已有文章報導了Nek2磷酸化β-catenin的位點以及調控蛋白功能機制。圍繞肝癌發生機制的研究方向，課題組改變策略，利用CRISPR/Cas9技術建立小鼠肝癌成瘤模型，以高通量的方式尋找促進肝癌發生的功能基因組合，揭示肝癌發生的機制。主要研究內容包括：1篩選肝癌關鍵驅動基因，構建gRNA個性化文庫；2鑑定gRNA文庫的工作效率；3尾靜脈高壓注射，構建小鼠成瘤模型；4對肝臟結節深度測序測序，尋找突變組合；5繪製成瘤圖譜，揭示腫瘤形成機制。重要結果：1根據近年測序報導的重要肝癌相關的腫瘤抑制因子突變譜和細胞內多種信號通路中關鍵節點因子，構建靶向34個肝癌驅動基因的gRNA文庫；2開發了一個可以檢測gRNA切割效率的體外報告系統，驗證了文庫中gRNA的工作效率，對工作效率差的gRNA進行替換；3對成瘤條件進行摸索，尋找到最佳成瘤的gRNA濃度，成功在小鼠中構建肝癌成瘤模型，成瘤時間縮短至2-3月；4成功分離多隻小鼠的肝臟腫瘤結節，對編輯位點進行深度測序，獲得突變譜；5將結節分成不同小塊，或將原代腫瘤細胞分離培養，進行單細胞測序，獲得突變譜。近年來大量的測序結果發現了許多癌症發生的相關基因突變，但是這些基因之間的相關性如何確無法得知。一般基礎研究也只能覆蓋一個或者幾個基因之間的聯繫。而基於CRISPR的高通量篩選工具，可以利用小鼠本身，自然地篩選出成瘤的基因突變組合，揭示出不同基因之間的相關性，最重要的是實現了高通量。同時通過結節分離和單細胞分離測序，我們能夠發現腫瘤形成過程中的特點。
