基本介紹
- 中文名：常間回文重複序列叢集/常間回文重複序列叢集關聯蛋白系統
- 外文名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system
- 縮寫：CRISPR/Cas 系統
構成,作用原理,分類,發現史,套用,
構成
顧名思義，這個系統最核心由兩個部分：CRISPR序列與CAS（CRISPR associate system）組成。
CRISPR序列是由可以感染原核生物的噬菌體DNA片段衍生來的。它可以檢測並摧毀能引起相似感染的其他噬菌體中相似的DNA，因此對原核生物抗噬菌體至關重要。它是由富含AT-的前導序列與跟隨其後的，被短重複序列隔開的特殊間隔序列（spacer）所組成。這些短序重複序列一般由28-37個鹼基對組成（總範圍23-55鹼基對），其中一些表現出二分對稱性（dyad symmetry）---暗示著其RNA可能具有髮夾環二級結構。而spacer一般32-38鹼基對組成（21-72bp）。新的spacer可以在免疫系統被新的噬菌體感染後出現，但是一般整個基因中只有少於50組的重複序列-spacer序列。
CAS是一種核酸內切酶。可以利用CRISPR序列中間隔序列（spacer）對應的RNA指引，識別並且切割特定與其序列互補的DNA鏈。
作用原理
這個由CRISPR/Cas系統構成的細菌防禦機制包含三個階段：（1）適應性階段，直接重複序列（repeat）被易變的DNA序列間隔開組成CRISPR序列，此時的DNA序列稱為spacer。Cas蛋白切割外來DNA片段，外來DNA片段稱為protospacer，然後將其整合到CRISPR序列上，這時外來DNA片段更名為spacer；（2）表達階段，CRISPR序列經過轉錄、切割成為成熟的crRNA；（3）干擾階段，crRNA招募Cas效應蛋白複合物特異性切割病毒同源性DNA。
從細節上來說，以最簡單的CRISPR/Cas9為例。系統由三個部分組成：1.反式激活 CRISPR RNA （tracrRNA）基因，2 CAS 基因，3. CRISPR 重複（repeay）-間隔（spacer）基因。這三部分轉錄生成Tracr RNA，Cas9蛋白，還有Pre-crRNA（pre-spacer containing RNA，即spacer containing RNA前體）。轉錄後，Cas9將tracrRNA與pre-crRNA配對後，由核糖核酸酶III在重複序列處切割。然後這個由crRNA-tracrRNA-Cas9組成的複合體就成為了可以被crRNA導航靶向性的被激活的核酸內切酶。這個被激活的複合體會在細菌內部隨機的來尋找適合的PAM進行外來DNA篩查。根據對PAM序列的識別，Cas9-RNA複合體將PAM後10-12鹼基位的DNA解旋審查。如果被審查的DNA序列與crRNA序列匹配，Cas9內切酶中的HNH核酸酶結構域就會將其切斷；同時Cas9中RuvC-like核酸酶結構區域將另一條互補鏈切段。（如概述圖所示）
分類
已發現兩大類，六種（19小種）不同類型的CRISPR/Cas系統存在。
其中I-III種為第一大類，也是被廣泛研究的一類。IV-VI是2015年後才被證實研究的。（根據2018年文章分類）（另一分類為，I，III，IV為一類；II，V，VI為二類。分類細節如圖1所示）。
圖1 CAS分類表
I類：需要一個多蛋白複合體---CRISPR RNA （crRNA）複合體，來識別DNA位點，然後Cas3進行切割。
II類CRISPR系統是研究最多，也是套用最廣泛的大名鼎鼎CRISPR/Cas9系統。因為其只需要一種蛋白，Cas9來進行篩查，貼合然後剪下目標基因。
III類：與I類相似，Cas10作用也需要一個類似的蛋白質複合體的幫助識別。
除了Cas9之外，被關注最多的是V類中的Cpf1，更名為Cas12a。
發現史
CRISPR序列最在是於1987年，Ishino等人在大腸桿菌中發現。在隨後的1993年相似的序列又在結核桿菌，與古鹽盒菌中被發現。雖然這段重複序列在隨後的十幾年中，於超過40%的細菌與90%的古細菌中都被發現。但是其作用一直到2002，Jansen 等人發現了CRISPR位點相鄰的基因與DNA代謝或者基因表達有關才被世人了解。另一個重大決定性發現是2005年，MoJica等人證實非重複性的CRISPR間隔區（spacer）包含外來的DNA序列，特別是噬菌體中的序列，並且一些在SCISPR位點帶有病毒DNA序列的細菌可以抵抗相對細菌的感染。
套用
CRISPR/Cas系統與鋅指核糖核酸酶(Zinc Finger nuclease，ZFNs)及轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease; TALENs)作為三大基因編輯工具(Genome editing tool)。但CRISPR/CAS系統與基於蛋白附著特定序列的的限制性內切酶ZFNs與 TALENs最大的不同是，它是用短RNA序列來作為特異性識別單位，進而被激活後使目標位置的雙鏈DNA斷裂。特別是CRISPR/Cas9 ，僅需要合成一段新的RNA就可以實現基因編輯，其設計簡單以及操作容易的特性為最大的優點，使這項技術成為了調控和觀察基因組的便捷、而且具備很強適應性的工具。這讓它可以在廣大領域中得到生物研究和生物技術方面的套用。CRISPR-Cas工具極大地加快了科學研究的腳步，而基於Cas的生物技術的研發同樣進步迅速。多項基於Cas9的臨床試驗正在或即將進行。這些臨床試驗的結果將指引未來體細胞基因編輯在體外和患者中的套用。CRISPR-Cas9在農業方面的套用已經產生了可以進入市場的產品。
