利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》是北京大學於2013年12月31日申請的發明專利，該專利的申請號為2013107517550，公布號為CN103668472A，授權公布日為2014年3月26日，發明人是魏文勝、周悅欣、朱詩優、蔡昌祖，該發明涉及基因體學及基因工程領域。

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》是先將編碼Cas9和OCT1蛋白的基因表達於真核細胞系中，篩選獲得穩定表達Cas9的細胞系，再進行文庫構建和功能篩選。其最大的優點在於：可將此方法套用於絕大多數真核細胞系中，不受特定細胞系的限制。另外，進行功能性篩選陽性率高，背景值低。大規模的篩選方法極大降低了成本，克服了單個製備基因敲除細胞，所導致的時間和勞動成本高的問題。

2016年12月7日，《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法
• 公布號：CN103668472A
• 公布日：2014年3月26日
• 申請號：2013107517550
• 申請日：2013年12月31日
• 申請人：北京大學
• 地址：北京市海淀區頤和園路5號
• 發明人：魏文勝、周悅欣、朱詩優、蔡昌祖
• Int.Cl.：C40B50/06(2006.01)I、C40B40/06(2006.01)I、C12Q1/68(2006.01)I
• 代理機構：北京路浩智慧財產權代理有限公司
• 代理人：王文君

專利背景

基因敲除，即針對某個特定的基因，通過破壞或改變其基因序列令其功能喪失的一種技術手段。常用的基因敲除方法包括：鋅指核酸酶（ZFNs）（Miller et al.,2007;Porteus and Baltimore,2003;Wood et al.,2011）、類轉錄因子活化因子核酸酶（TALEN）（Miller et al.,2011;Wood et al.,2011;Zhang et al.,2011），以及最近發現的原核生物第二類適應性免疫系統CRISPER/Cas9系統（Cong et al.,2013;Mali et al.,2013）等。CRISPER/Cas9系統原本被細菌免疫系統用來抵禦外源病毒或質粒。在第二類CRISPER系統中，Cas9核酸內切酶在sgRNA的引導下切割雙鏈DNA，造成基因組雙鏈斷裂，利用細胞基因組修復的不穩定性產生修復錯誤（鹼基的缺失或插入），從而可能造成基因功能的喪失，實現基因敲除的目的。

在基因敲除文庫產生之前，基於慢病毒載體的RNA干擾文庫成為研究基因功能的有效工具。由於其便利性，近年來shRNA文庫得以普遍套用，利用這類shRNA干擾文庫尋找與某特定功能相關的基因，方法概括如下：使用慢病毒包裝系統包裝病毒；使用病毒感染靶細胞；利用抗生素或流式細胞儀富集病毒感染並整合的細胞，即為文庫細胞；篩選具有待研究功能相關性狀的細胞；提取篩選出的細胞和未作處理的文庫細胞的基因組DNA；通過PCR擴增shRNA整合的區段或擴增shRNA文庫設計時自帶的條碼（barcodes），利用深度測序技術進行測序；將測序結果與已知shRNA進行匹配；分析計算不同shRNA的富集程度，從而進一步研究被高度富集的shRNA所對應基因的功能。

然而，shRNA文庫並不是基因敲除文庫，只能部分沉默基因表達。存在許多不足，例如對特定基因表達的影響往往不能導致表型的改變；可能錯誤地抑制不相關基因表達等。雖然有一些基因敲除文庫已被報導，特別是KBM7細胞，它是部分單倍體細胞，可用於構建敲除文庫，但其穩定性和效率都存在問題，而且該系統局限於特定細胞系，套用範圍受限。

發明內容

專利目的

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》旨在構建真核基因敲除文庫，以及基於功能性篩選高效快速鑑定基因功能的方法學，並能夠達到大規模、高通量及覆蓋全基因組的目的。

技術方案

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》首先提供一種利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法，包括以下步驟：

1）構建穩定表達OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細胞系：將編碼蛋白OCT1和Cas9的DNA序列通過柔性Linker連線，然後克隆至慢病毒載體pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD（SEQ ID No.1，圖8）上；用構建好的載體轉染真核宿主細胞；篩選穩定表達OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細胞系；

2）sgRNA質粒文庫的構建：

i.根據sgRNA作用位點的DNA序列5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22，設計併合成針對上述作用位點的sgRNA單體，針對同一個sgRNA作用位點設計兩個sgRNA單體，其序列分別為正向單體：5’-ACCG-Nx-3’，反向單體：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x為Nx的反向互補序列，N和N’表示鹼基A、T、G或C；

ii.將上述合成的針對同一個sgRNA作用位點的兩個sgRNA單體退火形成具有粘性末端的雙鏈DNA，並將針對所有基因合成的sgRNA單體經退火形成的雙鏈DNA等量混合；

iii.將人U6啟動子連線ccdB序列以及序列5’-G-Nx-NGG-3’之後，連入PLL3.7載體中替換原載體上的U6啟動子，將構建好的載體與ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性內切酶和T4連線酶，37℃5分鐘，16℃5分鐘，重複10個循環；

iv.將上述產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中，提取質粒，即構建得到sgRNA質粒文庫；

3）將上述質粒與質粒psPAX2和PMD2.G共轉染至HEK293T細胞中，培養細胞，收穫病毒液；

4）用收穫的病毒液按MOI=0.05接種步驟1）中構建得到的真核細胞系，細胞經培養後，使用流式細胞儀分選帶有綠色螢光的細胞，即獲得真核基因敲除的細胞文庫。

前述的方法，步驟1）中所述真核宿主細胞包括但不限於HEK293T、HT1080、HeLa細胞等。

前述的方法，步驟1）中所述柔性Linker序列為p2A：5′-GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT-3′。

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》還提供由上述方法構建的真核基因敲除細胞文庫。

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》進一步提供一種研究基因功能的方法，基於所述真核基因敲除細胞文庫，提取細胞的基因組DNA，設計引物，PCR擴增含有sgRNA序列的DNA片段，利用深度測序技術（Deep Sequencing）對擴增產物進行測序，分析測序結果，通過比較sgRNA的富集程度，來確定sgRNA所對應基因的功能。

其中，引物序列為正向引物：5’-TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC-3’，反向引物：5’-AATACGGTTATCCACGCGGC-3’。擴增的循環數為25-30個。

改善效果

《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》提供的真核基因敲除文庫的構建方法，先將編碼Cas9和OCT1蛋白的基因表達於真核細胞系中，篩選獲得穩定表達Cas9的細胞系，再進行文庫構建和功能篩選。其最大的優點在於：可將此方法套用於絕大多數真核細胞系中，不受特定細胞系的限制。另外，進行功能性篩選陽性率高，背景值低。大規模的篩選方法極大降低了成本，克服了單個製備基因敲除細胞，所導致的時間和勞動成本高的問題。

附圖說明

圖1為《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》Cas9表達載體（a）和sgRNA表達載體（b）的結構示意圖。

圖2為該發明利用CRISPR/Cas系統構建真核基因敲除文庫，並用於基因功能篩選的高通量方法學的實施流程圖。

圖3為該發明方法所涉及的系統在HEK293T、HT1080、HeLa三個細胞系中均可有效的造成基因組修復錯誤以達到基因敲除目的。

圖4為套用該發明所述方法分別使用炭疽毒素嵌合毒素和白喉毒素進行篩選後的候選陽性基因排序結果；其中，a：熱圖顯示使用sgRNA文庫結合深度測序分析篩選炭疽毒素及白喉毒素宿主相關基因的結果匯總；b和c：分別為炭疽毒素和白喉毒素篩選後所富集的sgRNAs以及它們所針對的基因。sgRNA的富集程度是通過計算標準化的平均實驗讀值除以對照值得到。圖表數值表示三個值的平均值，按照從高到低排列。紅色標記表示sgRNAs以及已知的毒素相關宿主基因。d和e：T7E1酶切法表示針對ANTXR1（d）或HBEGF（e）的各種不同sgRNAs所造成的特定DNA序列的插入或缺失突變率（indels）。

圖5為該發明實施例1中炭疽毒素嵌合毒素篩選後被最大富集的ANTXR1基因對於炭疽毒素嵌合毒素具有較強抗性，對白喉毒素不具有抗性。

圖6為該發明實施例1中炭疽毒素嵌合毒素篩選後候選基因中PECR基因對於炭疽毒素嵌合毒素具有一定的抗性，對白喉毒素不具有抗性。

圖7為該發明實施例2中白喉毒素篩選後被最大富集的HBEGF基因對於白喉毒素具有較強抗性，對炭疽毒素嵌合毒素不具有抗性。

圖8為該發明中載體pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD的結構示意圖。

權利要求

1.一種利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法，其特徵在於，包括以下步驟：

1）構建穩定表達OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細胞系：將編碼蛋白OCT1和Cas9的DNA序列通過柔性Linker連線，然後克隆至慢病毒載體pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD上；用構建好的載體轉染真核宿主細胞；篩選穩定表達OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細胞系；其中，載體pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD的序列如SEQ ID No.1所示；

2）sgRNA質粒文庫的構建：

i.根據sgRNA作用位點的DNA序列5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22，設計併合成針對上述作用位點的sgRNA單體，針對同一個sgRNA作用位點設計兩個sgRNA單體，其序列分別為正向單體：5’-ACCG-Nx-3’，反向單體：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x為Nx的反向互補序列，N和N’表示鹼基A、T、G或C；

ii.將上述合成的針對同一個sgRNA作用位點的兩個sgRNA單體退火形成具有粘性末端的雙鏈DNA，並將針對所有基因合成的sgRNA單體經退火形成的雙鏈DNA等量混合；

iii.將人U6啟動子連線ccdB序列以及序列5’-G-Nx-NGG-3’之後，連入PLL3.7載體中替換原載體上的U6啟動子，將構建好的載體與ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性內切酶和T4連線酶，37℃5分鐘，16℃5分鐘，重複10個循環；

iv.將上述產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中，提取質粒，即構建得到sgRNA質粒文庫；

3）將上述質粒文庫中的質粒與質粒psPAX2和PMD2.G共轉染至HEK293T細胞中，培養細胞，收穫病毒液；

4）用收穫的病毒液按MOI=0.05接種步驟1）中構建得到的真核細胞系，細胞經培養後，使用流式細胞儀分選帶有綠色螢光的細胞，即獲得真核基因敲除的細胞文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1）中所述真核宿主細胞包括但不限於HEK293T、HT1080、HeLa細胞。

3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1）中所述柔性Linker序列為p2A：5′-GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT-3′。

4.根據權利要求1-3任一項所述方法構建的真核基因敲除細胞文庫。

5.一種研究基因功能的方法，其特徵在於，基於權利要求4所述的細胞文庫，提取細胞的基因組DNA，設計引物，PCR擴增含有sgRNA序列的DNA片段，利用深度測序技術對擴增產物進行測序，分析測序結果，從而確定sgRNA所對應基因的功能。

6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述引物序列為正向引物：5’-TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC-3’，反向引物：5’-AATACGGTTATCCACGCGGC-3’。

實施方式

實施例1構建CRISPER/Cas9基因敲除文庫並篩選與炭疽毒素（anthrax toxin）細胞毒性相關的基因

1.文庫sgRNA的設計

針對296個基因，每個基因找到2-3個sgRNA靶位點，詳見表1。

表1：sgRNA文庫的基因組成、sgRNA靶位區域及用於構建sgRNA質粒的引物序列

2.高表達Cas9的HeLa細胞的篩選

（1）將OCT1和Cas9的DNA序列通過2A連線並通過Gibson克隆方法裝載到慢病毒載體pLenti-CMV-MCSSV-Bsd上；

（2）將上述載體通過包裝慢病毒感染的方法轉入目標細胞；

（3）在上述細胞的培養液中加入殺稻瘟菌素（blasticidin）進行篩選，並挑取穩定表達Cas9的單克隆；

3.文庫質粒的構建

（4）尋找sgRNA作用位點，序列為5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22；

（5）合成針對上述作用位點的sgRNA單體，針對每一個位點，其序列為，正向：5’-ACCG-Nx-3’，反向：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x為Nx的反向互補配對序列；

（6）sgRNA載體的構建，將人的U6啟動子連線ccdB以及gRNA結構，用酶Xba1和Xho1連入PLL3.7載體中替換原載體上的U6啟動子；

（7）將上述合成的針對同一個sgRNA位點的兩個單體，用TE緩衝液稀釋到10微摩爾/升，各取22.5微升，加入5微升TaqHifiBuffer，加熱至95℃，然後自然冷卻至室溫；

（8）上述針對所有基因sgRNA的產物等量混合；

（9）上述混合物與（6）中構建的載體混合，加入BsmBI限制性內切酶和T4連線酶，37℃5分鐘，16℃5分鐘，重複10個循環；

（10）上述產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中；

（11）從上述轉化產物中提取質粒，構建文庫質粒；

4.文庫病毒的包裝

將293T細胞以3×10的密度平鋪於4個10厘米直徑的細胞培養板中，使用聚氮丙啶（PEI）將文庫質粒和其它兩種病毒包裝質粒psPAX2和PMD2.G轉入細胞，70小時後，收穫病毒液；

5.文庫細胞的構建

將篩選出的表達Cas9的HeLa細胞以4×10的密度平鋪於10個15厘米直徑的細胞培養板中，用上述病毒液按MOI=0.05進行感染，感染48小時後，使用流式細胞儀篩選出表達綠色螢光的細胞；

6.使用炭疽毒素進行篩選

將篩選出的細胞以1×10的密度平鋪於10個10厘米的細胞培養板，共三組平行實驗，在培養液中加入PA蛋白70納克/毫升，LFn-DTA蛋白50納克/毫升，培養48小時，更換新鮮培養液，重複此過程三次；

7.提取基因組DNA並擴增

提取存活的細胞和另外三組未作任何處理的文庫細胞的基因組DNA，使用上述引物進行PCR擴增，每組作為模板的基因組DNA總量為8微克，PCR進行26個循環，純化PCR產物；

8.測序並分析

純化後的PCR產物使用HiSeq2500進行測序，並根據sgRNA在毒素處理前後的豐度變化進行排序，排在前三位的均為已知的炭疽毒素的受體。並尋找到一個新的可能與炭疽毒素毒性作用有關的基因PECR。

實施例2 構建CRISPER/Cas9基因敲除文庫並篩選與白喉毒素（diphtheria toxin）細胞毒性相關的基因

1.文庫sgRNA的設計

針對296個基因，每個基因找到2-3個sgRNA靶位點，詳見表1。

2.高表達Cas9的HeLa細胞的篩選

（1）將OCT1和Cas9的DNA序列通過2A連線並通過Gibson克隆方法裝載到慢病毒載體pLenti-CMV-MCSSV-Bsd上；

（2）將上述載體通過包裝慢病毒感染的方法轉入目標細胞；

（3）在上述細胞的培養液中加入殺稻瘟菌素（blasticidin）進行篩選，並挑取穩定表達Cas9的單克隆；

3.文庫質粒的構建

（4）尋找sgRNA作用位點，序列為5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22；

（5）合成針對上述作用位點的sgRNA單體，針對每一個位點，其序列為，正向：5’-ACCG-Nx-3’，反向：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x為Nx的反向互補配對序列；

（6）sgRNA載體的構建，將人的U6啟動子連線ccdB以及gRNA結構，用酶Xba1和Xho1連入PLL3.7載體中替換原載體上的U6啟動子；

（7）將上述合成的針對同一個sgRNA位點的兩個單體，用TE緩衝液稀釋到10微摩爾/升，各取22.5微升，加入5微升TaqHifiBuffer，加熱至95℃，然後自然冷卻至室溫；

（8）上述針對所有基因sgRNA的產物等量混合；

（9）上述混合物與（6）中構建的載體混合，加入BsmBI限制性內切酶和T4連線酶，37℃5分鐘，16℃5分鐘，重複10個循環；

（10）上述產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中；

（11）從上述轉化產物中提取質粒，構建文庫質粒；

4.文庫病毒的包裝

將293T細胞以3×10的密度平鋪於4個10厘米直徑的細胞培養板中，使用聚氮丙啶（PEI）將文庫質粒和其它兩種病毒包裝質粒psPAX2和PMD2.G轉入細胞，70小時後，收穫病毒液；

5.文庫細胞的構建

將篩選出的表達Cas9的HeLa細胞以4×10的密度平鋪於10個15厘米直徑的細胞培養板中，用上述病毒液按MOI=0.05進行感染，感染48小時後，使用流式細胞儀篩選出表達綠色螢光的細胞；

6.使用白喉毒素進行篩選

將篩選出的細胞以1×10的密度平鋪於10個10厘米的細胞培養板，共三組平行實驗，在培養液中加入DT蛋白7.5納克/毫升，培養48小時，更換新鮮培養液，重複此過程三次；

7.提取基因組DNA並擴增

提取存活的細胞和另外三組未作任何處理的文庫細胞的基因組DNA，使用上述引物進行PCR擴增，每組作為模板的基因組DNA總量為8微克，PCR進行26個循環，純化PCR產物；

8.測序並分析

純化後的PCR產物使用HiSeq2500進行測序，並根據sgRNA在毒素處理前後的豐度變化進行排序，排在第一位的為已知的白喉毒素的受體。

參考文獻

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榮譽表彰

2016年12月7日，《利用CRISPR/Cas9系統構建真核基因敲除文庫的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。