《利用CRISPR/Cas系統建立新型乳酸菌基因組編輯技術》是依託山東大學，由郭婷婷擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：利用CRISPR/Cas系統建立新型乳酸菌基因組編輯技術
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：郭婷婷
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
對基因組進行定點敲除、插入和替換是研究基因功能和代謝工程的重要手段，但是傳統的乳酸菌基因組修飾工具存在效率低、實驗周期長、表型不穩定等缺陷。II型CRISPR/Cas系統是目前建立的一種新型基因組編輯工具，已經成功的套用於原核和真核生物的基因組靶向修飾。本項目擬利用這種系統的關鍵元件Cas9、sgRNA，構建重組表達質粒pGCs，建立乳酸乳球菌基因組靶向編輯平台；以綠色螢光蛋白為報告基因，對基因組打靶，通過檢測螢光值及基因的轉錄水平，確定螢光蛋白的定點插入效率及最優打靶條件；在此基礎上，利用源自枯草芽孢桿菌的血紅素合成基因簇（hemeALBCD、hemEY）分步打靶基因組，分析菌株血紅素合成能力與有氧條件下的生物量及細胞存活性，進一步證明II型CRISPR/Cas系統對乳球菌基因組定向編輯的有效性，建立新型的乳酸菌基因組靶向編輯技術，為乳酸菌的遺傳改造和代謝途徑最佳化提供高效準確的操作工具。
結題摘要
乳酸菌是重要的工業菌株，同時也是動物體內的正常菌群。對乳酸菌代謝改造和新功能的開發需要對其基因組進行編輯，然而傳統操作體系存在效率低、突變表型不穩定的缺陷，亟待開發高效的遺傳操作工具。因此本研究以CRISPR/Cas9系統在乳酸菌中的適用性為出發點，結合原噬菌體同源重組系統、Cre/loxP位點特異性重組系統開發了一系列可用於乳酸乳球菌和乾酪乳桿菌基因組靶向突變、基因刪除和插入的工具盒。 首先，將CRISPR/Cas9系統的關鍵元件在乳酸乳球菌和乾酪乳桿菌中重組表達並打靶多個基因組位點，建立乳酸菌基因組打靶平台；結合原噬菌體重組酶RecT高效的在乳酸乳球菌NZ9000中完成目的基因的定點突變、小於100bp片段無痕刪除和34bp loxP序列的插入。鑑定新型的同源重組系統LCABL_13040-50-60，結合Cre/loxP位點特異性重組工具完成乾酪乳桿菌基因組的點突變、小片段刪除及綠色螢光蛋白基因的插入。利用Cre/loxP位點特異性重組工具建立大片段DNA插入體系，完成血紅素合成基因簇在乳球菌基因組上的靶向插入。基於苯丙氨酸tRNA合成酶α亞基的構建乳酸菌反向篩選系統，提高同源重組和無縫突變的效率。以上為乳酸菌的遺傳改造提供高效準確的新型基因組編輯工具。
