《基於CRISPR/Cas技術的中國板栗NdPDR1抗性基因的功能研究》是韓珊為項目負責人，四川農業大學為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：基於CRISPR/Cas技術的中國板栗NdPDR1抗性基因的功能研究
- 外文名：Study on the function of NDPDR1 resistance gene in Chinese chestnut based on CRISPR/CAS technology
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：韓珊
- 依託單位：四川農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
板栗疫病是世界上危害最為嚴重的森林病害之一。套用植物抗病基因工程培育抗病品種是防治栗疫病最有效的途徑。目前中國板栗抗栗疫病相關基因及功能研究尚未見報導，基因組編輯技術CRISPR/Cas系統在林木中套用亦無相關報導。首先對已有資料庫中國板栗基因組序列進行生物信息學分析，篩選並確定一段長度為4674bp的編碼序列與菸草NdPDR1抗性基因高度同源，提示該基因與板栗抗性密切相關。然後以NdPDR1基因為待敲除位點，採用CRSPR/Cas技術，構建可表達gRNA的質粒，用重組根瘤農桿菌轉化板栗愈傷組織，獲得抗性基因缺失植株。最後通過愈傷組織抗性測試分析，揭示NdPDR1抗性基因對抗栗疫病的影響。本研究有助於闡明中國板栗對栗疫菌的抗性機制，為栗疫病防治奠定基礎。
結題摘要
板栗疫病嚴重危害中國板栗的生長，制約板栗產業的發展，而套用植物抗病基因工程培育抗病品種是防治栗疫病最有效的途徑。本研究採用RT-PCR，對CmPAL基因cDNA和DNA序列進行克隆及生物性息學分析分析，結果表明CmPAL基因全長2273 bp，包含一個2130 bp完整的閱讀框，編碼709個胺基酸，蛋白相對分子質量約77.35 kDa包含一個典型的PAL酶活性中心序列(GTISSSGDLVPLSYIAG)，且該基因DNA序列無內含子，GenBank登錄號為KU060149。根據gRNA靶標序列特點，篩選出中國板栗CmPAL基因高度特異性靶標位點，使用農桿菌介導的轉基因技術將構建成功的敲除載體轉入板栗愈傷組織中；通過GFP螢光蛋白檢測發現，轉入敲除質粒後的愈傷組織均能檢測到綠色螢光，而對照均無此螢光，表明gRNA/Cas9敲除質粒成功轉入愈傷組織並正常表達。螢光定量PCR檢測發現，與對照組相比，經gRNA1/Cas9和gRNA3/Cas9敲除質粒處理後板栗愈傷組織CmPAL基因表達量分別下降了80.53%和39.85%（P＜0.05）。利用CRISPR/Cas技術，本課題組已獲得中國板栗抗性基因的敲除突變體，為將來開展基因功能研究和板栗遺傳改良奠定了基礎。
