《CRSIPR/Cas系統在酵母途徑工程中的調控與套用》是依託北京理工大學，由李珺擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：CRSIPR/Cas系統在酵母途徑工程中的調控與套用
- 依託單位：北京理工大學
- 項目負責人：李珺
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
釀酒酵母因其安全、遺傳背景清楚被廣泛地套用於醫藥、食品和化工等領域重要產品生產的途徑重構中，由於現有基因調控方法在多基因敲除和下調過程中效率較低，限制其在重要天然產物生物合成中的套用。鑒於CRSIPR/Cas系統在古細菌中高效、專一調控目標DNA的轉錄而調節自身免疫力的作用機制，本項目擬探索CRISPR/Cas系統在釀酒酵母細胞中的設計原理和作用規律，研究CRISPR/Cas系統在多基因調控中同時敲除和下調中的主要影響因素和調控規律，最佳化獲得該系統在釀酒酵母中的最佳表達方式，從而建立CRISPR/Cas系統在釀酒酵母途徑工程中多基因調控的設計和組裝方法，並將其套用於重要三萜化合物β-香樹脂醇的途徑工程最佳化中，實現釀酒酵母外源途徑與內源途徑的高效平衡調控，為在釀酒酵母中進行複雜途徑重構的多基因可控調節提供新思路和新方法。
結題摘要
甘草次酸（GA）是一種五環三萜化合物，具有多種生理活性，被套用到食品、醫藥和化妝品等許多領域。課題組前期已在釀酒酵母中成功實現了甘草次酸的生物合成，但是由於酵母自身代謝網路極其複雜，外源代謝途徑極易被內源途徑影響，其重要前體物乙醯輔酶A和β-香樹脂醇供應不足及釀酒酵母中內外源代謝途徑不平衡導致甘草次酸產量較低, 大大限制了其規模化生產和廣泛套用。CRISPR/Cas9是一種簡單有效的基因編輯工具，可以同時對多個基因進行插入刪除或者替換，也可對代謝途徑中多個關鍵基因進行下調或上調，被廣泛套用於代謝工程領域。本研究在生產β-香樹脂醇的工程菌株SGibSd中成功構建CRISPR各系統，在SGibSd中，利用CRISPRa上調甾醇合成途徑的轉錄激活因子UPC2，β-香樹脂醇產量較出發菌株提高了23%；利用CRISPRa同時上調ALD6、CAB1和UPC2時，β-香樹脂醇的產量是出發菌株的2.14倍。在生產甘草次酸的菌株GA104中，利用CRISPRa上調β-香樹脂醇合酶βAS基因，獲得最佳化的工程菌株GA104-14，其甘草次酸的產量達18.46 mg/L，較出發菌株提高了7.3倍。本項目在生產天然產物的工程酵母中成功構建CRISPR各系統，並對合成β-香樹脂醇和甘草次酸的內外源代謝途徑平衡方面進行了許多探索和研究。最終使得甘草次酸產量達18.46 mg/L。為後續的β-香樹脂醇和甘草次酸的高效合成和工業化套用提供了關鍵理論基礎。
