高密度培養，主要是在用基因工程菌（尤其是E.coli）生產多肽類藥物的實踐中逐步發展起來的。具體方法為選取最佳培養基成分和各成分含量。
基本介紹
- 中文名：高密度培養
- 發展基礎：基因工程菌生產多肽類藥物
- 套用領域：生物製藥
- 代表：人生長激素
技術介紹,具體方法,
技術介紹
具體方法
（1）選取最佳培養基成分和各成分含量。
（2）補料，這是工程菌高密度培養的重要手段之一。
（3）提高溶解氧的濃度，提高好氧菌和兼性厭氧菌培養時的溶氧量也是高密度培養的重要手段之一。
（4）防止有害代謝產物的生成。
（2）補料，這是工程菌高密度培養的重要手段之一。
（3）提高溶解氧的濃度，提高好氧菌和兼性厭氧菌培養時的溶氧量也是高密度培養的重要手段之一。
（4）防止有害代謝產物的生成。
高密度培養過程中培養基成分及作用：
根據微生物對營養的要求，培養基包括水分、碳源、氮源、無機元素和生長素等五大類物質，此外還應有一定的酸鹼度和滲透壓。一般來講，不同種類的微生物對培養基的要求是不同的，甚至同一種類的微生物在不同的生長階段及使用目的時，對培養基的要求也不完全相同。有三種類型的培養基：合成培養基、複合培養基和半合成培養基。當營養物濃度可知並且在培養過程中可控制，合成培養基通常用於獲得高細胞密度。在複合培養基中的營養物，比如蛋白腖和酵母粗提物，可以在成分和質量上有所變化，這使得用複合培養基的發酵可重複性低。然而。半合成或複合培養基有時對於促進產物形成是必需的，即在合成培養基中加入少量酵母粉、蛋白腖等，以及少量無機鹽和胺基酸有助於菌體的生長及產物的形成。
碳源
Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源，當培養基中含有葡萄糖和乳糖時，細菌優先使用葡萄糖，當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經過短時間適應，就能利用乳糖作為碳源。還原型的碳化合物常用於構建細胞和形成產物。除了葡萄糖，也可採用一些其他天然有機化合物做為碳源，用於生長和生產。培養基中的碳源濃度相當重要。如培養基中碳源含量超過5%，細菌的生長因細胞脫水而開始下降。使用不同的碳源對菌體生長及外源基因表達有影響。葡萄糖和甘油相比，它們所導致的菌體比生長速率及呼吸強度相差不大，但甘油的菌體得率較小，而葡萄糖所產生的副產物較多。用甘露糖作碳源時，不產生乙酸，但比生長率和呼吸強度較小。對tac啟動子的表達系統，使用乳糖作碳源較有利，乳糖同時起誘導作用，葡萄糖對lac啟動子有抑制作用，原因有：(1)降低胞內cAMP水平，(2)誘導物排外作用。採用流加措施，控制培養液中葡萄糖濃度在低水平，可減弱或消除葡萄糖的阻遏作用。
氮源
氮源的作用主要是提供胺基酸、蛋白質、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分為有機氮源和無機氮源，有機氮源主要是一些含氮有機物的水解產物，含有豐富的胺基酸、小肽和其他營養物，其中的胺基酸和其它一些小分子有機物可被工程菌直接利用，而不需要再從糖代謝的中間代謝產物合成了，因而對工程菌的生長和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培養中被廣泛使用，但有機氮一般價格較高，而且，工程菌對有機氮源中各成分的利用是不均衡的，因而過量使用會使某些成分發生積累，產生抑制作用或影響後續純化工作。常用的有機氮源有：酵母提取物、蛋白腖、酪蛋白水解物、玉米漿等。無機氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、銨鹽等。無機氮源的優點是價格低廉且成分確定，易於按需補加。其中氨水在工程菌培養過程中還可同時起到調節pH的作用。
無機鹽和維生素
工程菌培養基中所需的無機鹽主要為磷酸鹽、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的鹽類，其作用是提供菌體生長所需的各種元素，同時還有維持滲透壓和控制pH的作用。大多數工程菌都能合成所需的各種維生素，可以在不含有維生素的培養基中生長，但在培養基中含適量的維生素往往對菌體的生長是有利的，而有些工程菌的宿主菌為維生素營養缺陷型，這些菌的培養基中必需含相應的維生素。酵母提取物、玉米漿等有機氮源中含有豐富的無機鹽和維生素，因而當培養基中含有較高濃度的上述成分，且菌密度較低時，除加入20-100mmol/L的磷酸鹽用於維持pH和滲透壓外，不需另外補加無機鹽和維生素。但當培養基中不含有機氮源或培養的菌密度較高時，則應考慮補加無機鹽和維生素。
對一個合適的發酵培養基，上述各成分的量應以滿足或略多於菌體生長和產物合成所需為度，不宜過多加入，以免產生抑制效應和浪費原料，另外各成分的配比也很重要，以利於菌體均衡利用各成分。表1.1為基本培養基中一些主要營養元素的得率係數，表1.2為一些營養成分產生抑制效應的濃度。但對每個工程菌，其發酵培養基最終應通過實驗篩選。
任何發酵培養基的最佳化是一個高強度勞動的過程，需要實驗大量的營養化合物種類及其濃度。工程菌高密度培養基設計原理如下：（1）使用基本培養基以便精確設計營養成分之間的定量關係，同時避免任何不利於細菌生長的營養限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻斷細菌對數生長期間抑制性代謝產物的合成；（3）依據細菌細胞的元素組成確定培養基各成分的精確配比。培養基中的碳氮比（C/N）是相當重要的，如果碳氮比偏小，會導致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌體則會生長緩慢，產率下降。即使碳氮比合適，濃度的大小也會影響菌體的生長。
表1.1培養基中主要營養元素的得率係數
碳源
Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源，當培養基中含有葡萄糖和乳糖時，細菌優先使用葡萄糖，當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經過短時間適應，就能利用乳糖作為碳源。還原型的碳化合物常用於構建細胞和形成產物。除了葡萄糖，也可採用一些其他天然有機化合物做為碳源，用於生長和生產。培養基中的碳源濃度相當重要。如培養基中碳源含量超過5%，細菌的生長因細胞脫水而開始下降。使用不同的碳源對菌體生長及外源基因表達有影響。葡萄糖和甘油相比，它們所導致的菌體比生長速率及呼吸強度相差不大，但甘油的菌體得率較小，而葡萄糖所產生的副產物較多。用甘露糖作碳源時，不產生乙酸，但比生長率和呼吸強度較小。對tac啟動子的表達系統，使用乳糖作碳源較有利，乳糖同時起誘導作用，葡萄糖對lac啟動子有抑制作用，原因有：(1)降低胞內cAMP水平，(2)誘導物排外作用。採用流加措施，控制培養液中葡萄糖濃度在低水平，可減弱或消除葡萄糖的阻遏作用。
氮源
氮源的作用主要是提供胺基酸、蛋白質、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分為有機氮源和無機氮源，有機氮源主要是一些含氮有機物的水解產物，含有豐富的胺基酸、小肽和其他營養物，其中的胺基酸和其它一些小分子有機物可被工程菌直接利用，而不需要再從糖代謝的中間代謝產物合成了，因而對工程菌的生長和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培養中被廣泛使用，但有機氮一般價格較高，而且，工程菌對有機氮源中各成分的利用是不均衡的，因而過量使用會使某些成分發生積累，產生抑制作用或影響後續純化工作。常用的有機氮源有：酵母提取物、蛋白腖、酪蛋白水解物、玉米漿等。無機氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、銨鹽等。無機氮源的優點是價格低廉且成分確定，易於按需補加。其中氨水在工程菌培養過程中還可同時起到調節pH的作用。
無機鹽和維生素
工程菌培養基中所需的無機鹽主要為磷酸鹽、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的鹽類，其作用是提供菌體生長所需的各種元素，同時還有維持滲透壓和控制pH的作用。大多數工程菌都能合成所需的各種維生素，可以在不含有維生素的培養基中生長，但在培養基中含適量的維生素往往對菌體的生長是有利的，而有些工程菌的宿主菌為維生素營養缺陷型，這些菌的培養基中必需含相應的維生素。酵母提取物、玉米漿等有機氮源中含有豐富的無機鹽和維生素，因而當培養基中含有較高濃度的上述成分，且菌密度較低時，除加入20-100mmol/L的磷酸鹽用於維持pH和滲透壓外，不需另外補加無機鹽和維生素。但當培養基中不含有機氮源或培養的菌密度較高時，則應考慮補加無機鹽和維生素。
對一個合適的發酵培養基，上述各成分的量應以滿足或略多於菌體生長和產物合成所需為度，不宜過多加入，以免產生抑制效應和浪費原料，另外各成分的配比也很重要，以利於菌體均衡利用各成分。表1.1為基本培養基中一些主要營養元素的得率係數，表1.2為一些營養成分產生抑制效應的濃度。但對每個工程菌，其發酵培養基最終應通過實驗篩選。
任何發酵培養基的最佳化是一個高強度勞動的過程，需要實驗大量的營養化合物種類及其濃度。工程菌高密度培養基設計原理如下：（1）使用基本培養基以便精確設計營養成分之間的定量關係，同時避免任何不利於細菌生長的營養限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻斷細菌對數生長期間抑制性代謝產物的合成；（3）依據細菌細胞的元素組成確定培養基各成分的精確配比。培養基中的碳氮比（C/N）是相當重要的，如果碳氮比偏小，會導致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌體則會生長緩慢，產率下降。即使碳氮比合適，濃度的大小也會影響菌體的生長。
表1.1培養基中主要營養元素的得率係數
Table1.1yieldcoefficientofvariouselement
元素得率係數（g菌體/g元素）*
C.1.2
N5
P36
S278
Mg588
Ca7.1x103
Fe7.1x103
*得率係數：在基本培養基中，當某元素為限制性基質時，每克該元素所能產出的菌體量。
**碳源的得率係數：隨碳源的不同變化較大，這裡的碳源為葡萄糖。
表1.2營養成分產生抑制效應的濃度
Table1.2Inhibitionconcentrationofvariousnutrients
元素營養物抑制濃度(g/L)
葡萄糖50
氮3
磷酸鹽10
Fe2+1.15
Mg2+8.7
Zn2+0.038
元素得率係數（g菌體/g元素）*
C.1.2
N5
P36
S278
Mg588
Ca7.1x103
Fe7.1x103
*得率係數：在基本培養基中，當某元素為限制性基質時，每克該元素所能產出的菌體量。
**碳源的得率係數：隨碳源的不同變化較大，這裡的碳源為葡萄糖。
表1.2營養成分產生抑制效應的濃度
Table1.2Inhibitionconcentrationofvariousnutrients
元素營養物抑制濃度(g/L)
葡萄糖50
氮3
磷酸鹽10
Fe2+1.15
Mg2+8.7
Zn2+0.038
