食用菌制種技術

食用菌制種技術基本器具有試管、菌種瓶、塑膠袋、孢子收集器、天平、溫度計、濕度計、孢子收集器。

基本介紹

• 中文名：食用菌制種技術
• 儀器：試管、菌種瓶、塑膠袋
• 滅菌設備：高壓蒸汽滅菌鍋
• 接種設備：接種箱、接種室、超淨工作檯

設備及程式

配料稱量設備

試管有多種規格，常用的是21mm×200mm、25mm×200mm。

菌種瓶一般容量是750ml、口徑3cm的玻璃瓶，也有用罐頭瓶、廣口瓶生產的。效果以前種規格為好。但均要求能耐高溫、高壓，並要無色透明，便於檢查菌絲生長和雜菌污染情況。

生產菌種的塑膠袋要求用聚丙烯薄膜袋，常用的規格是17cm×34cm。塑膠頸圈高3cm，直徑3.5cm。用橡皮筋或塑膠繩扎口。

藥物天平、托盤式天平，稱量1000g，感量-1.0g；扭力天平，稱量100g，感量0.01g；分析天平，稱量100g，感量0.1—1.0g。可根據不同要求選用。

孢子收集器是用來採收菌類孢子的一種裝置，包括底盤、培養皿、三角架、紗布及有孔燈罩或鐘罩等。

拌料設備主要有拌料機、鐵鏟等。

裝料設備主要有裝料機、鐵鏟等。

滅菌設備

主要有滅菌鍋。滅菌鍋是一個可以密閉並能耐受一定壓力的金屬鍋。鍋底（或夾層）盛水，加熱後由於鍋內（夾層）蒸汽增加而壓力加大，溫度或高，從而殺死鍋內容物的雜菌菌體及孢子，達到滅菌的目的。滅菌鍋有兩種：

1．高壓蒸汽滅菌鍋，具有滅菌時間短，效果好，省燃料等優點。缺點是投資較大，工廠生產的手提式、直立式、臥式等，也有用鋼板自製的。

2．土蒸鍋，是自製的常壓蒸汽滅菌鍋。

接種設備

接種設備有接種箱、接種室、超淨工作檯、負離子發生器

接種箱用木材和玻璃製成，要求密閉。接種箱的前後裝有兩扇能啟閉的玻璃窗，下方開兩個小洞口，洞口裝有布袖套。箱的大小可自行決定，以方便操作為宜。接種箱結構簡單製造方便，成本低，且體積小，便於消毒徹底。

接種室要求密閉、乾燥，體積5m3—7m3為宜，外面應設有一間緩衝室，兩室的上方要求安裝紫外線滅菌燈及日光燈。

超淨工作檯是利用過濾滅菌的原理，先將空氣過濾，得到無菌空氣，然後將無菌空氣從風洞處打出，使工作檯範圍內成無菌狀態。

負離子發生器是採用強電離對空氣進行滅菌的一種新方式。通過電離使用菌體蛋白質和核酸變性死亡，滅菌效果較理想。

培養設備

培養設備有培養室、電熱恆溫培養箱。

培養室是培養菌種的場所。室內裝有放置菌種的架子。要求乾燥向陽，房間不宜過大，面積20—25m2，以培養5000—6000瓶菌種為宜 。

電熱恆溫培養箱是採用自然對流通外式的結構，冷空氣從底部風孔進入，經電熱器加溫後，從兩側對流孔間上升，並從內膽左右側小孔進入內室，再經箱頂的封頂蓋調節，使內室溫度均恆。

溫度計、濕度計。用來觀察培養室、栽培室等處溫度、濕度、以便根據情況加以調節。常用的有棒形溫度計和乾濕球溫度計。

工藝流程

（一）菌種的概念和類型

在自然界中，食用菌繁衍後代依靠孢子，孢子借風力傳播到適宜的環境下，萌發成菌絲體，菌絲體生長繁衍到生理成熟後，在一定的條件下，就可形成子實體。在人工栽培食用菌時，孢子雖然是它的“種子”，但一般不用孢子直接播種（有些為異宗配合），而是用孢子或子實體組織細胞經培養萌發形成的純菌絲體作為播種材料。

因此，通常所指的菌種，實際上是經過人工培養並進一步繁殖的食用菌的純菌絲體。

制種是食用菌生產最重要的環節。菌種的優劣，直接影響到食用菌的產量和質量。

優良菌種包含兩大方面的含義：一是指菌種本身的生物學特性，如高產、優質、抗逆性強；二是指菌種純度高、無蟲害、無雜菌。因此培育優良的菌種，是提高食用菌生產水平的重要環節。

人工培養的菌種，根據菌種培養的不同階段，可分為母種、原種和栽培種3類。一般把從自然界中，首次通過孢子分離或組織分離而得到的純菌絲體稱為母種，或稱一級種。它是菌種類型的原始種。原始母種通過移接(轉管)成數支試管(斜面)種，這些移接的試管種，亦可稱為母種。把母種接到木屑、穀粒、棉子殼、糞草等瓶(袋)裝培養基上培養而成的菌種稱為原種，或稱二級種。它是母種和栽培種之間的過渡種。把原種擴接到相同或類似的材料上，進行培養直接用於生產的菌種稱栽培種，或稱三級種。

（二）制種的程式

食用菌的菌種生產，一般按三級菌種的生產程式，基本上是按菌種分離→母種擴大培養→原種培養→栽培種培養的程式（工藝流程）進行。

製作

培養基是用人工方法配合各種營養物質，供給食用菌生長繁殖的營養基質。培養基必須具備三個條件：第一，有食用菌生長所需的物質，如水分和養分，這些物質要有合適的比例；第二，具有一定的生化反應所需的合適酸鹼度和一定的緩衝能力，具有合適的滲透壓和一定的氧化還原電位；第三，必須經嚴格滅菌，保持無菌狀態。

由於食用菌菌種培育通常採用三級生產，即母鐘培育、原種培育和栽培種培育，所以和生產菌種相套用的培養基也可分為三種類型。

一級種培養基的製備

馬鈴薯瓊脂培養基。是通用的食用菌母種培養基。其組成是：馬鈴薯200克、瓊脂20克、蔗糖20克、水1000毫升。

按配方組成配製分裝於試管里、管口塞棉塞。及時滅菌，滅菌時間不能太長，一般以30分鐘即可，以免消毒時間過長會破壞培養料的營養成分，不利於菌絲生長。

消毒結束後立即取出試管斜放於桌面上，做成斜面培養基。挑取2-3支試管放置於250C恆溫箱中培養3-5天，若培養基表面沒有發現雜菌以及乳白色細菌產生，則表示滅菌徹底，可供擴接母種使用。

二級種三級種培養基的製備

原種、栽培種培養基可用相同配方，配製步驟也基本相同。原種由母種繁殖而成，主要用於繁殖栽培種，但也可直接用於栽培生產。

原種、栽培種常用培養基：

① 木屑培養基：木屑78%，麩、糠20%，石膏1%，糖1%，水適量，適用於平菇、木耳、香菇、猴頭。

② 棉子殼培養基：棉子殼78.5%，麩、糠20%，石膏1.5%，水適量，適用於平菇、猴頭、金針菇、雞腿菇。

③ 糞草培養基：稻草（切碎）78%，乾糞20%，石灰、石膏各1%，水適量，適用於蘑菇，草菇，雞腿菇，姬松茸。各種培養料應是無霉爛、新鮮、乾燥。各種培養基的含水量應保持在60%左右。

將培養料拌勻裝入菌種瓶（或袋）內、裝料鬆緊適宜，上下一致，裝料高度以齊瓶（袋）肩為宜。然後用錐形木棒在瓶的中央向下插一個小洞，塞上棉塞。裝好的料瓶（袋）要當天滅菌，以免培養料發霉變質。

滅菌與消毒

各種微生物都由蛋白質組成，加熱滅菌可以使蛋白質凝固從而達到殺死微生物的目的。加熱滅菌經濟有效，簡便易行，可分為乾熱滅菌和濕熱滅菌兩種。

乾熱滅菌

1、火焰滅菌是直接利用火焰反微生物殺死的方法，它中適用於金屬制的工具，玻璃器皿口等物品的滅菌。

2、乾熱滅菌是利用熱空氣進行滅菌的方法。滅菌溫度140℃—160℃，時間2—3h，它只適用於金屬及玻璃器皿的滅菌。電熱乾燥箱是乾熱滅菌常用的設備。

濕熱蒸汽滅菌

1、高壓蒸汽滅菌 利用高溫高壓蒸汽滅菌，是一種最有效、使用最廣泛的滅菌方法。蒸汽壓力與溫度成正比。高壓滅菌所採用的蒸汽壓力與時間，應根據具體物質而定。

高壓滅菌鍋的形成與規格較多，有立式、臥式、手提式，能源用電、蒸汽、煤等。

使用高壓蒸汽滅菌鍋應注意以下幾點：

①滅菌鍋內的冷空氣必須排盡；②滅菌鍋內的基質排列一定要稀疏些。使蒸汽流運暢通；③滅菌時升壓和降壓要緩慢；④滅菌過程應注意保持棉塞乾燥。

2、常壓蒸汽滅菌法 這是利用自然壓力的蒸汽滅菌的方法。可用土蒸鍋，蒸蘢等滅菌。由於常壓，溫度較高壓的低得多，故滅菌時間要長。其優點是結構簡單、成本低、便於自製，適宜於家庭制種。

消毒

1、低溫消毒法（巴氏消毒法）一些不耐高溫的食品，如牛奶、果子酒、醬油等，需要低溫消毒，加熱到60℃維持30min，即可殺死食品中的病原菌及多數細菌營養體。

蘑菇培養料的後發酵，就是採用巴氏消毒法，殺死有害於蘑菇的病蟲雜菌。

2、沸水消毒法 主要用於針筒等器材的消毒，將有關的器材置沸水中燒煮一定時間，以殺死微生物的營養體。

3、化學藥劑消毒法 這是利用化學藥劑進行殺菌的方法。殺菌劑的種類及使用濃度：

①重金屬鹽類：所有的重金屬鹽類對微生物都有素害作用，如硝酸銀、氯化汞等。

②氧化劑：常用的氧化劑有高錳酸鉀、過氧化氫、漂白粉、漂白精等，常用的高錳酸鉀溶液濃度是0.1%，氯氣自來水清潔劑濃度為1ppm，漂白精濃度為400ppm。

③、有機化合物：甲醛（福馬林）5%甲醛溶液用於種子表面消毒，原液可用於接種箱、培養室、栽培室等空間消毒，熏蒸用量6—10ml/cm3。

新潔爾滅：0.25%新潔爾滅溶液可用作皮膚、種子消毒。

4、乾燥消毒利用乾燥使微生物失水，達到殺菌或抑菌的目的，稱為乾燥消毒。食物、藥品等經過適當乾燥，便可長時間保存，蘑菇乾片即是。

5、滲透壓消毒利用高滲透壓殺菌或抑菌的方法稱滲透壓消毒。在高滲溶液中，微生物細胞由於脫水，質壁分離，不能正常進行新陳代謝而死亡，鹽水蘑菇就是利用這一原理製成。

分離與培養

菌種的分離

食用菌菌種分離方法有四種，即組織分離法、孢子分離法、耳木分離法和土中菌絲分離法。

（一）組織分離法

組織分離法是利用子實體內部組織來獲得純菌種的方法，根據不同的分離材料大體可分為三種。

1、子實體組織分離

①、種菇的選擇 從優良的品系中選取優良的個體作種菇，以單生菇、菇形圓整、無病蟲害菇作分離材料。

②分離 把種菇帶入接種箱內，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部縱切一刀，然後撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織，接種到PDA培養基上，數天后就可看到組織塊及培養基上有白色菌絲，即表明分離成功。

2、菌核組織分離 茯苓、豬苓、雷丸等藥用菌，常利用菌核分離得到菌種。分離方法是將菌核表面消毒後，用解剖刀切開，取中間組織1小塊，接入PDA培養基上，20℃—25℃培養。

3、菌索分離 密環菌，假密環菌常用菌索來分離。方法是將菌索表面消毒後，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用無菌剪刀剪成小段。移接在PDA培養基上，20℃—25℃培養，有白色菌絲長出且無污染，即表明分離成功。

（二）孢子分離法

孢子分離法是利用菌類的成熟孢子能自動彈射的原理，在無菌操作條件下，使孢子在適宜的培養基上萌髮長成菌絲體而獲得菌種。

1、種菇的選擇 孢子分離用的形態不同，孢子分離的方法也不同。

①整菇插種法：是將整隻成熟度適當的種菇，經表面消毒後，插入孢子採集器內，放在適當的溫度下，讓其彈射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法採集孢子。

②鉤懸法：將新鮮的成熟度適當的耳片用無菌水沖洗後懸掛在無菌的三角瓶內或有孔鐘罩內，在一定溫度下讓其彈射孢子。木耳、銀耳常用此法採收孢子。

（三）、耳木（菇木）分離法

耳木（菇木）分離法是利用耳木或菇木中的菌絲體得到菌種的方法。

1、耳木的採集與選擇 一般在該菌的生長季節里，選取生長的子實體大、肉質厚、成熟度適當、無雜菌感染的耳木或菇木進行分離。

2、分離方法 在所選耳棒長有子實體的部位，橫斷面鋸下鋸成1cm厚薄的木片，帶入已經消毒的接種箱（或接種室）內。將上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用無菌水沖洗數次，以衝去殘留的升汞液，放在無菌紗布上吸乾水分，多面手用滅過菌的榔頭，解剖刀切去樹皮部分，把木片劈成小塊，隨後用鑷子將小木塊放入PDA培養基上，每管放一塊，放適宜溫度下培養。

（四）土中菌絲分離法

它是利用菌類地下的菌絲體來分離得到菌種的一種方法。主要用於腐殖質腐生菌的分離，用前述三種方法能分離得到菌種，一般不採用這一方法。但在野外採集時，菇類子實體已腐爛，而又十分需要該菌種時，就要用此法分離。具體操作如下：

①取菇體下與菇根相連的菌絲體，儘可能取較清潔的菌絲束。

②由於土壤中含有各種微生物，如細菌、放線菌、黴菌等，因此分離時要用無菌水反覆沖洗菌絲束，把附著的泥土等雜物沖洗乾淨，把無菌棉花或紗布吸乾水分。

③取菌絲束尖端部分，接入有細菌抑制劑的培養基中，25℃左右培養，無雜菌污染即分離成功。

④菌絲的鑑定。在土中獲得的菌絲，其可靠性較小，必須經過出菇鑑定，才能確認是該菌的菌種。

菌種的培養

接種後的原種或栽培種全部拿出培養箱或培養室，根據不同食用菌菌絲髮育最適溫 度進行培養。培養2～3天后，菌絲開始生長時，要每天定期檢查，如發現黃、綠、橘紅、黑色雜菌時，要及時揀出清理。尤其是塑膠袋菌種，檢查工作到菌絲長滿為止。培養室切忌陽光直射，但也不要完全黑暗；注意通風換氣，室內保持清潔，空氣相對濕度不要超過65%；同時菌種瓶、袋不要堆疊過高，瓶間要有空隙，以防溫度過高造成菌絲衰老，生活力降低。特別是對加溫的培養室要注意：一要保持室內溫度的穩定，因在溫差較大的情況(特別是母種培養)會形成冷凝水，而使菌絲倒伏變黃。有條件的話，可根據菇類的菌絲生長對溫度的要求，按品種分開放在不同溫度的培養室(箱)內培養。同時要注意經常調換原種、栽培種排放的位置以使同一批菌種菌絲生長一致。二要注意通風換氣，以免室內二氧化碳濃度過高而影響菌絲生長。

菌種保藏

一個優良菌株被選育出來以後，必須保

持其優良性狀，防止雜菌污染，才不致降低生產性能。因此保藏好菌種，對研究和生產食用菌都具有十分重要的意義。菌種保藏的方法有斜面低溫、沙土管、液體石蠟封藏、冷凍真空及液氮超低溫等。

斜面低溫保藏法

這是最簡單最普通的保藏方法，即將菌種在適宜的斜面培養基上培養成熟後，置於4—5'C的低溫下保藏，以後每隔2～3個月轉管一次。此法適用於除草菇外的所有食用菌菌種。草菇對低溫忍耐力差，它的菌絲體在5 0C下即易死亡，因此草菇菌種應保藏在lo～13'(2的環境中。若需置於4～5℃的低溫下保藏，應在草菇菌苔上灌注3～4mL的防凍劑。一般生產上，草菇多採用室內常溫保藏。

低溫保藏菌種的培養基一般用營養豐富的天然培養基，如馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養基等。為防止菌種在保藏過程中產生酸過多，在配製保藏用培養基時需添加少許緩衝鹽，如磷酸二氫鉀(KH2P04)或碳酸鈣等。

斜面低溫保藏菌種雖然簡便，但保藏時間較短，需經常轉管，故容易發生退化現象。為了彌補這一缺點，在生產上，最好把斜面低溫保藏法與其他保藏法結合起來，以減少轉管次數。母種在第一次轉管時，儘量多移斜面試管，部分用第一次生產，取幾管作礦油保藏(或冷凍乾燥、液氮低溫保藏)，其餘則作為以後幾批生產用的母種，暫存於4～6'C低溫處，待低溫保存的菌種用完後(或超過儲存期後)，再從第一代礦油保存的菌種移出殖。這樣做能使每批生產使用的菌種都保持在前幾代的水平上，有利於菌種優良性狀的保持(圖3—1)。

液體石蠟保藏法

食用菌菌絲均可用石蠟保藏，一般可保存3年以上，但最好1—2年移接一次，即使不移接，室溫下可保藏6～8個月。用此法保藏的菌種不必置於冰櫃內，室內比冰櫃內保藏效果更好。

液體石蠟又名礦油，是一種導瀉劑，在醫藥商店有售。分裝於三角瓶中加棉塞封口，高壓蒸汽滅菌2～3次(每次30min)，然後經無菌檢查合格後方可使用。由於高壓蒸汽滅菌常有水蒸氣滲入，需在4'C溫箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸發。用無菌吸管將滅菌石蠟加入要保藏菌種斜面試管內，用量要高出斜面尖端約lcm。將棉塞齊口剪平，再用蠟密封管口。

使用礦油保藏菌種時，不必倒去礦油，用接種工具從斜面上取一小塊菌絲先在無菌水

中洗滌，然後移接於斜面培養基上即可。原母種可重新封口繼續保藏。

沙土保藏法

此法是將食用菌孢子保藏於乾燥的無菌沙土中，保藏期為2一10年。具體方法如下：

1．取河沙過篩(60～80目篩子)，除去大沙粒，用10%的鹽酸浸泡以除去有機物。鹽

酸用量以淹沒沙面為宜。浸泡2～4h後，倒去鹽酸，用水洗幾次，直到接近中性，烘乾或曬

乾。

2．沙與土比例以2 ：l～4 ：1為宜，沙過多影響菌種保藏質量，土過多時易結塊，接

種後抽乾困難。

3．把乾沙、土按比例混合壓裝於安瓿管或小試管，裝入量以0.5～lcm為宜，加棉塞，

高壓蒸汽滅菌(壓力在0．15MPa)滅菌3次，每次30min，乾熱滅菌(160℃，2h)。待無菌檢

查合格後(取少許乾沙土放入牛肉湯培養液中，無菌生長)方可使用。

4．用接種環將孢子接於沙土管中拌勻即可。或將孢於接於5mL無菌水的試管中，

充分播勻成孢於懸液，然後用lmL無菌吸管吸取孢子懸液加入沙土管中(每管加0.2mL)

即可。

5．將接種後的沙土管置於盛有乾燥劑(生石灰、氯化鈣或矽膠)的容器內，接上

0．5KW的真空泵抽氣約8h，使沙土基本乾燥。

6．經抽樣檢查，證明無雜菌生長，即可封口進行保藏。

四，真空冷凍乾燥保藏法

此法是採用真空、乾燥和低溫三種手段來保藏菌種，因此菌種保藏期長達10～20年 後仍不降低其原有性能。

冷凍乾燥保藏的基本方法是將需要保藏的孢子懸液裝在特製的安瓿管中，然後驟然 冰凍，並立即抽成真空，使培養物以固體形態升華脫水，熔封后在低溫或室溫下保藏。

試驗證明，用此法保藏蘑菇、香菇、側耳和金針菇等食用菌的孢子和銀耳的芽孢子3 年，全部存活，直至8年後仍有90%存活。可見用此法保藏食用菌孢子至少可存活8年。 但此法不能用來保藏不長孢子的菌類。

其他保藏方法

（一）液體超低溫保藏法

試驗證明，用一130～一196℃液體氮超低溫冰櫃能保藏所有食用茵菌種，包括一些不 能用冷凍乾燥保藏的菌種，甚至“怕冷”的草菇以10%甘油和5%～10%二甲基碸做保護 劑，居然也能在超低溫冰櫃中保藏。由於超低溫能使代謝水平降到最低限度，因此菌種基 本上不發生變異。

在啟用液氮超低溫保藏的菌種時，應先將安瓿管置於35～40℃的溫水中，使管中的 冰塊迅速溶解，然後再啟安瓿管，取懸浮的菌絲塊移植在培養基上活化培養。

（二）菌絲球生理鹽水法

先將食用菌菌種用液體振盪培養3～7天，然後將形成的菌絲球吸入裝有5mL無菌 生理鹽水的試管中，每管約移人4—5個菌絲球。試管用無菌橡皮塞塞上，並用蠟封口，置 室溫或4℃下保藏。一般可保藏1～2年。

（三）麥粒菌種保藏法

麥粒菌種保藏法是利用麥粒作培養料。用於保藏菌種的麥粒，含水量在25%左右， 這樣的麥粒，在滅菌後種皮不破裂。製作方法；先將小麥浸水5h，濾去水後晾乾麥粒表面 的水分，裝入小試管，裝入量為試管高的l/3；高壓蒸汽滅菌(壓力0.15MPa)滅30min；冷卻後接人孢於液或菌絲懸浮液，搖勻後置於適溫培養。當試管中的麥粒發滿菌絲後，放人 裝有氯化鈣的乾燥器內，進行抽氣乾燥，乾燥後，將乾燥器放於低溫(20℃以下)處保藏。 此法保藏菌絲，經1～2午後，再接到培養基上，菌絲生長仍然良好。