基本介紹
- 中文名：非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
- 外文名：Non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis
- 用途：酶的鑑定、同工酶分析和提純。
- 原理：蛋白質進行聚丙烯醯胺凝膠電泳
實驗原理,實驗器材與試劑,實驗步驟,結果與分析,注意事項,
實驗原理
非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS 和巰基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，常用於酶的鑑定、同工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的解析度，尤其是在電泳分離後仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對於生物大分子的鑑定有重要意義，其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳，電泳後將凝膠切成兩半，一半用於活性染色，對某個特定的生物大分子進行鑑定，另一半用於所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。
聚丙烯醯胺凝膠電泳
聚丙烯醯胺凝膠電泳非變性聚丙烯醯胺凝膠和變性SDS-PAGE電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯醯胺凝膠的配製和電泳緩衝液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是鹼性還是酸性蛋白。分離鹼性蛋白時候，要利用低pH凝膠系統，分離酸性蛋白時候，要利用高pH凝膠系統。 酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中採用的pH是8.8的緩衝系統，蛋白會帶負電荷，蛋白會向陽極移動；而鹼性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離鹼性蛋白。
實驗器材與試劑
1、電泳儀、電泳槽、離心機等
實驗步驟
1、PAGE膠電泳緩衝液配置
3)分離膠緩衝液貯液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16gTris溶解在80mL雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調pH8.9。再用雙蒸水稀至100mL，保存在4°C備用。
4)10%（AP）過硫酸銨：0.1g過硫酸銨溶入1.0mL雙蒸水，使用前新鮮配製。
5)電極緩衝液(0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14gTris加上72.07g甘氨酸，用雙蒸水稀釋到5L。可在室溫保存一個月。
2、Native-PAGE配方
分離膠： |
雙蒸水 6.6ml |
30%丙烯醯胺溶液 8.0ml |
1.5mol/L Tris(pH8.8) 5.0ml |
10%過硫酸銨溶液 (W/V) 200μl |
TEMED 15μl |
濃縮膠： |
雙蒸水 6.8ml |
30%丙烯醯胺溶液 1.7ml |
0.5 mol/ LTris(pH6.8) 1.25ml |
10%過硫酸銨溶液 (W/V) 100μl |
TEMED 10μl |
3、Native-PAGE電泳
將玻璃板、膠墊、梳子用雙蒸水洗乾淨，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配製分離膠(12%)和濃縮膠(5%)如表1。過硫酸銨和TEMED最後加入，加入後聚合即開始，應立即混勻倒入兩塊玻璃板之間。分離膠倒入兩塊玻璃板間，應該留下適合的高度，使點樣孔前端離分離膠有2.5cm左右的距離，在膠頂部緩緩加入約0.5cm高的雙蒸水，待分離膠聚合完全後，傾去上層的雙蒸水，用雙蒸水清洗凝膠頂層，用吸水紙吸去殘餘的水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層，插上梳子，待濃縮膠聚合完全後，拔去梳子，立即用雙蒸水清洗點樣孔。加入電極緩衝液，將樣品用微量進樣器點入點樣孔底部，200伏電泳。當溴酚藍到達分離膠時，電壓改為250伏，繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部。將凝膠剝下，浸泡在100ml的底物液中，染色1小時，待膠帶顯色後立即照相。然後將凝膠進行常規的考馬斯亮藍染色。
結果與分析
記錄和觀察電泳過程中的溫度變化，電泳完後進行活性染色時凝膠有色條帶的變化。對比活性染色和常規的考馬斯亮藍染色後凝膠中蛋白質條帶的變化。
注意事項
1. 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳的過程中，蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關，還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關，其中蛋白質的等電點是最重要的影響因子，要根據蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩衝系統；
3. 蛋白質的分子量較大，則電泳時間可以適當延長，以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開，反之亦然;
4. 變性樣品的離子強度不能太高（I<0.1mM）。上樣buffer中沒有SDS之外，加入樣品後不能加熱。
