鋅指核酸酶基因修復治療地中海貧血的研究

《鋅指核酸酶基因修復治療地中海貧血的研究》是依託中山大學，由蔡柳洪擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：鋅指核酸酶基因修復治療地中海貧血的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蔡柳洪
• 依託單位：中山大學

中文摘要

地中海貧血（地貧）主要是由於基因缺失或變異而導致相應的珠蛋白缺失或不足。在全面綜述國內外人誘導式多能幹細胞（iPS ）相關研究進展和基因打靶技術進展，以及本項目組相關前期工作的基礎上，針對廣東地區是地貧高發區這一特點，提出建立無外源基因整合的地貧病人特異iPS細胞，構建組織特異表達的供體質粒，利用鋅指核酸酶在iPS細胞的AAVS1位點（安全港）基因打靶目的基因（α或β基因），進而誘導基因打靶後的iPS細胞向造血幹細胞和紅細胞分化，最後獲得能組織特異表達正常珠蛋白基因的iPS細胞。本項目的研究成果將為研究地貧發病機制提供實驗模型，為最終達到利用iPS細胞進行基因治療根治地貧提供理論基礎。本項目的研究，不僅對利用iPS細胞和鋅指核酸酶的理論與技術根治地貧有重要的學術價值，為基因治療地貧提供了理想的移植細胞，其研究方法和技術對解決其他難治性遺傳性疾病的治療問題，具有重要的學術借鑑作用。

結題摘要

背景：地中海貧血（地貧）主要是由於基因缺失或變異而導致相應的珠蛋白缺失或不足，重型患者是家庭和社會的巨大負擔，但目前除了異體幹細胞移植沒有根治的方法，而異體幹細胞移植又存在供體不足、免疫排斥和費用高昂等問題。而患者特異的誘導式多能幹細胞（iPS ），在進行基因修飾的基礎上，有可能替代異體幹細胞成為供體來源，其研究方法和技術對解決其他難治性遺傳性疾病的治療問題，具有重要的學術借鑑作用。 主要研究內容：建立無外源基因整合的地貧病人特異iPS細胞，構建donor 載體和g RNA，利用CRISPR-Cas9技術基因修飾地貧iPS細胞的缺陷位點，進而誘導基因打靶後的地貧iPS細胞向造血幹細胞和紅細胞分化，最後獲得能組織特異表達正常珠蛋白基因的脫核紅細胞。 重要結果： 1. 獲得了三個輸血地貧患者的的iPS細胞系，目前生長良好。按照之前已經建立的“integration-free”再程式化方案，建立了外周血細胞來源的三個iPS細胞系（名字分別為HZK,HZX,HMT）。目前均已經完成鑑定。 2. 更高效的誘導分化的方法。之前採用與OP9共培養的方法，將iPS細胞誘導分化為造血前體細胞的效率比較低。通過較長時間的摸索，結合文獻資料，項目組現在採用兩階段法進行誘導分化，最終獲得了脫核紅細胞，脫核率約為2%-5%。 3. 因為構建的鋅指核酸酶載體轉基因效率低，未能篩選出陽性細胞，轉而進行CRISPR-Cas9轉基因操作。成功構建了CRISPR-Cas9基因打靶的donor 載體和g RNA。 4. 目前三個細胞系已經進行轉染，並篩選出正確基因打靶的細胞，並已經完成向無核紅細胞誘導分化。 關鍵數據及其科學意義：本項目將基因修飾後的地貧患者iPS細胞定向誘導分化，最終獲得了成熟的、脫核紅細胞，通過流式細胞儀篩選將脫核紅細胞進行純化，為基因治療地貧提供了理想的移植細胞。本項目的研究，不僅對利用iPS細胞和鋅指核酸酶的理論與技術根治地貧有重要的學術價值，其研究方法和技術對解決其他難治性遺傳性疾病的治療問題，具有重要的學術借鑑作用。