酶標抗體法

酶標抗體法，又名酶聯免疫吸附法（ELISA），利用酶標記抗原或抗體以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。其基本原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性，而相對應的抗體或抗原與某種酶連線成酶標抗體或抗原，酶標抗體或抗原既保留了免疫活性可以與固相載體表面的抗原或抗體結合，又保留了酶活性能夠以酶為檢測信號，加入酶反應的底物後，底物被酶催化為有色產物，產物的量與受檢抗體或抗原的量成比例，故可根據顏色深淺來定性或定量分析。酶標抗體法具有靈敏性強，特異性高，重複性好，檢測速度快的特點，尤其適用於大批量樣本檢測，是國際認可的標準化診斷方法。

基本介紹

• 中文名：酶聯免疫吸附法
• 外文名：Enzyme linked immunosorbent assay
• 縮寫：ELISA

基本操作步驟

包被—封閉—加樣—孵育一抗—洗滌—孵育二抗—洗滌—顯色—終止—讀數

常用標記的酶

鹼性磷酸酶

辣根過氧化物酶

分類

依據檢測目的不同，酶標抗體法有間接法，雙抗體夾心法，競爭法和抗體捕獲法等。

間接法

主要是利用酶標記的抗抗體檢測已與固相結合的受檢抗體，是檢測抗體最常用的方法。將特異性抗原與固相載體連線，形成固相抗原，洗滌除去未結合的抗原及雜質。加入稀釋的受檢樣品（如血清），樣品中特異性抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體複合物。經洗滌後固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。加入酶標抗抗體與固相複合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。最後加底物顯色，依據顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

雙抗體夾心法

檢測抗原最常用的方法。將特異性抗體與固相載體連線，形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質。加受檢標本，使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原複合物。洗滌除去其他未結合的物質。加酶標抗體使固相免疫複合物上的抗原與酶標抗體結合，徹底洗滌未結合的酶標抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。夾心式複合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

競爭法

可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。將特異抗體與固相載體連線，形成固相抗體，洗滌後加入受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，孵育後酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌後加底物顯色，參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淺，表示標本中抗原含量越多。

抗體捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法。先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG後再測定特異性IgM。將抗IgM抗體連線在固相載體上，洗滌後加入稀釋的血清標本，洗滌後加入特異性抗原，洗滌後再加入酶標抗體，最後洗滌加底物顯色。

相關套用

農藥殘留檢測

農藥殘留常用的快速檢測方法有酶抑制法和ELISA。酶試劑易失活導致反應不穩定，檢測結果誤差較大，重複性差。ELISA法操作步驟簡便，適用於樣品量較大的分析篩選，但是ELISA受限於抗體和抗原的製備和提取。已建立檢測毒死蜱殘留的ELISA方法，檢測DDT及其相關化合物的ELISA方法，測定套種氰戊菊酯直接競爭ELISA法等。

獸藥殘留檢測

獸藥殘留常用的方法有微生物法、儀器分析法、微生物法適用於對畜禽組織中的抗菌藥物進行篩選檢驗，該方法雖然能檢測高濃度的殘留，但是檢測限高於樣品所規定的的最高殘留限量。因此ELISA成為廣泛套用的快速檢測獸藥殘留的方法。已建立檢測動物組織中的呋喃妥因代謝物的直接競爭化學發光酶免疫法，檢測呋喃唑酮代謝物的間接競爭ELISA法等。

致病微生物檢測

不論是在開發中國家還是已開發國家，對食品安全影響較大的是致病微生物引起的食源性疾病，而在人們食物鏈中，單增李斯特菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌都是重要的食源性致病菌。已建立檢測沙門氏菌的雙抗夾心ELISA法，檢測單增李斯特菌的ELISA法，耐熱菌間接競爭ELISA快速檢測方法等。

生物毒素檢測

以免疫學為基礎的檢測方法如ELISA具有實驗周期短、設備簡單、操作簡便等特定而被廣泛套用。已建立檢測黃麴黴毒素B1直接競爭ELISA法，檢測豬肉和雞肉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的直接競爭ELISA法，基於噬菌體展示技術的酶聯免疫吸附分析檢測赭麴黴毒素A的方法等。

非法添加的非食用物質檢測

酶標抗體法作為一種經濟快速的檢測方法在食品中違法添加的非食物質檢測中也有套用。利用獲得的單克隆抗體建立了三聚氰胺的間接ELISA法並製備了試劑盒，檢測蘇丹紅I的直接競爭ELISA法，間接競爭ELISA法測定鹼性橙II等。

重金屬檢測

重金屬檢測方法有原子吸收光譜法、原子螢光法、陽極溶出伏安法、催化極譜法和電感耦合電漿質譜法，這些方法均不能滿足快速檢測的要求。而酶標抗體法可提高檢測速度。建立了檢測重金屬鎘的間接競爭ELISA法，Pb和Cr的間接競爭ELISA，一步競爭ELISA對環境水樣中的Cd檢測等。

過敏原檢測

ELISA已經廣泛套用於臨床化學和食品分析中，也是檢測食品中過敏原的一種快速有效的方法。依據酶標抗體法建立了魚過敏原小清蛋白的雙抗夾心ELISA法，杏仁過敏原苦杏仁球蛋白的雙抗體夾心ELISA法等。

轉基因檢測

檢測轉基因物質的雙抗體夾心ELISA具備多克隆抗體費用較低。單克隆抗體親和力高的特點，使得後續研究開發的試劑盒檢測成本低廉，靈敏可靠，而且可以穩定、方便地提供標準化試劑，便於實現工業化生產。雙抗體夾心ELISA檢測方法的研究和建立，為製備免疫膠體金試紙條提供了便利，為建立轉基因動物的現場、快速查驗技術打下基礎，所以這種檢測方法將成為轉基因檢測領域研究的主要方向之一。