基本介紹
- 中文名：酶標記抗體
- 來源：方便
- 比活性：高
- 性質：穩定
- 標記方法：簡易過碘酸鈉法
- 獲取抗體： 可通過提取純化而獲得
酶製劑及其底物,標記抗體的方法,原理,標記步驟,結果判定,試劑及器材,簡易過碘酸鈉法,原理,標記步驟,結果判定,試劑及器材,工作濃度的選擇,注意事項,
酶製劑及其底物
凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：(1)來源方便，易於純化；(2)比活性高，性質穩定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由於辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易製備，所以最常用。HRP廣泛分布於植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶於水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度並不表示酶活性，如當酶變性後，RZ值仍可不變。
HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3－二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉澱物，並有電子密度，故適宜於做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用於ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少套用。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由於產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，後者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近於無色，靈敏度上據報導後者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。
由於HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經較短時間反應後呈色即達高峰（說明H2O2已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。
標記抗體的方法
戊二醛二步法
原理
標記步驟
(1) 稱取HRP25mg溶於1.25%戊二醛溶液中，於室溫靜置過夜。
(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩衝液0.25ml，繼續攪拌3?小時。
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，最後沉澱物溶於少量0.15M PH7.4的PBS中。
結果判定
(1) 定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然後用酶的底物使沉澱弧顯色，可初步鑑定其活性。最後以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標記步驟比較簡單，重複性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶與蛋白質結合。
試劑及器材
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩衝鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50μl與PH6.8的PBS1ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶於0.01M PH9.5碳酸緩衝液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計，離心機。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
簡易過碘酸鈉法
本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然後再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和Ig結合，99%的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。
原理
經典的過碘酸鈉法中需採用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。後來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化後形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，後者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。
標記步驟
(1) 稱取5mgHRP溶解於1ml蒸餾水中。
(2) 於上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然後立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩衝液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。
其餘步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。
結果判定
除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其餘均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
試劑及器材
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩衝液:
0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液:
Na2CO3 0.32克
NaHCO3 0.586克
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩衝液。
(4) NaBH4溶液(4mg/ml):
臨用時稱取NaBH44mg溶於1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。
工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由於濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附於固相載體上，然後將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩衝液稀釋為10μg/ml左右，於聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩衝液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時後洗滌。然後加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際套用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可採用方陣法)，以達到最適的實驗條件。
注意事項
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配製。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩定，常加入30～40%甘油於-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。已配製的使用液應在12小時內用完。切忌反覆凍融。
