親和膜分離，是一種利用親和配基修飾的膜（親和膜）為介質的分離純化生物大分子的技術。
基本介紹
- 中文名：親和膜分離
- 別稱：膜親和層析
- 適用領域範圍：純化生物大分子
- 包括：親和吸附、洗脫、親和膜再生
簡介,工作原理,改性,製備,親和絡合,洗脫,再生,製備流程,配基,間隔臂,載體,配基的偶聯,結構形式,技術特點,操作方式,套用領域,
簡介
是膜分離技術和親和層析技術的有機結合。其分離過程包括親和吸附、洗脫、親和膜再生等步驟。多採用錯流方式，達到分離與濃縮之雙重目的。該技術的關鍵是製備適宜的親和膜。具有傳質阻力小、達到吸附平衡的時間短、配基利用率高、設備體積小等優點。膜污染等導致吸附效率低、膜壽命下降是其主要問題。可實現生物大分子的高效、大規模分離純化。如以A蛋白為配基的親和膜全自動分離純化系統可一步完成除菌、純化和濃縮操作，用於純化小鼠單抗的速度可達傳統層析法的100倍。
工作原理
親和膜（affinity membrane）是利用親和配基修飾的濾膜。親和膜分離是以親和膜為親和吸附介質純化目標產物的分離方法，是親和色譜的變型，又稱膜親和色譜（membrane-based affinitychromatography）。
親和膜分離過程如下：
改性
基於在微孔濾膜或超濾膜上所具有的某些官能團，通過適當的化學反應途徑，將其改性，接上一個間隔臂（Spacer），一般應是大於3個碳原子的化合物。
製備
選用一個適合的親和配基（Ligand），在一定條件下讓其與間隔臂分子產生共價結合，生成帶有親和配基的膜分離介質。
親和絡合
將樣品混合物緩慢地通過膜，使樣品中欲分離的物質與親和配基產生特異性相互作用，產生絡合，生成配基和配位物（Ligate）為一體的複合物（Complex），其餘不和膜上配基產生親和作用的物質則隨流動相通過膜流走。
親和作用是范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵、化學鍵等作用力的綜合表現，親和吸附時載體與配基之間主要遵循以下互補匹配原則：幾何形狀互補匹配；靜電相互作用互補匹配；氫鍵相互作用互補匹配；疏水相互作用互補匹配。
下表列出了親和載體與目標蛋白的可能結合形式及其原因：
結合形式 | 產生原因 |
離子間的相互作用 | 主要因胺基酸側鏈的電荷引起靜電作用 |
氫鍵結合 | 配體含O 或N 原子時, 與結合部位形成氫鍵 |
疏水性相互作用 | 配體與結合部位都含有非極性基團 |
對金屬原子配位 | 目標分子與配體的一部分都與同一金屬原子配位 |
弱共價鍵結合 | 如醛基和羥基間形成的弱共價鍵, 存在可逆性 |
洗脫
改變條件，如洗脫液的組成、pH值、離子強度、溫度等，使複合物產生解離，並將解離物收集起來，進一步處理。用親和膜色譜法純化生物大分子時，使用的緩衝液組成、pH值和離子強度，以及操作時的加料速度和溫度、洗脫方式、洗脫液的組成和性質是影響產品純度甚至成敗的關鍵因素。尤其使用特異性比較低的配基時，要特別注意純化條件和洗脫方式的選擇。洗脫方式有特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫就是在洗脫液中加入對配基有更強親和力的物質，將目標蛋白質置換下來。而改變緩衝液中的鹽濃度、pH值、溫度、加入變性劑等則屬於非特異性洗脫。
再生
將解離後的親和膜進行洗滌、再生、平衡，以備下次分離操作時再用。
製備流程
親和膜的製備方法主要有以下兩種路徑：
（1）膜材料→成膜→活化→配基偶聯，此法主要是利用現有的商品膜，通過對其進行偶聯改性來獲得所需要親和膜；
（2）膜材料→活化→配基偶聯→成膜，此法從最簡單的膜材料入手，先製備功能化的膜材料，再使之成膜。
配基
配基是親和膜分離技術的核心，是指能夠與目標產物進行可逆的特異性結合的分子或基團，按其來源和作用對象分類見下表所示。
配基類別 | 配基種類 | 特點 | 備註 |
按來源分類 | 天然配基 | 凝集素、肝素、核苷酸、蛋白A、蛋白G等 | 性能優於人工合成配基，但製取和提純較困難，價格昂貴且使用條件苛刻。 |
人工合成配基 | 活性染料、過渡金屬離子、人工合成肽段、烷基等 | ||
按作用對象分類 | 特異性配基（生物特異性配基） | 肝素——肝素酶； HPA52單抗——血漿纖維蛋白溶酶原激活劑（HPA52）； 尿激酶單抗——尿激酶； HSA單抗——人血清白蛋白（HAS）； 伴刀豆蛋白A——外源凝集素； DNA——DNA結合蛋白質； 小麥胚凝集素——病毒細胞受體； 聚尿嘧啶核昔酸（Poly（U））——聚腺嘌呤核昔酸（Poly（A））； VIII因子抗體——VIII因子； | 這類配基只與其對應的分子特異性結合，選擇性很高，純化倍數高；但缺點是來源缺乏，費用高，生物化學穩定性差，在固載化中難以保持活性，多需預純化，工業化難度大 |
通用性配基（基團特異性配基） | 克服了特異性配基的缺點，但純化倍數不如特異性配基高，有些則有毒性。 |
間隔臂
為了減小空間位阻，提高配基的有效使用率和利用率，通常需要在介質與配基間共價鍵合間隔臂，尤其當配基是小分子而純化對象為大分子時。間隔臂一般都是雙官能團化合物，例如二氨基二丙胺，二氨基己烷，氨基己酸，乙二胺，胺基酸，胺化環氧化物等。一般情況下可使用含六個碳原子的間隔臂如己二胺、6-氨基己酸等。間隔臂有疏水性間隔臂和親水性間隔臂，如己二胺是疏水性的，而1,3-二氨基-2-丙醇、小膚、低聚甘氨酸、聚(L-賴氨酸)等是親水性的。間隔臂的親、疏水性將影響配基的親和力大小及所合成介質的特異性。間隔臂過短起不到減小空間位阻的作用，而過長又可能通過彎曲封閉膜上的相鄰的活性位。
載體
在親和膜分離技術中，分離膜即為配基和間隔臂的載體，其特異性是影響親和吸附總效率的重要因素之一。理想的載體應具有高度特異性（表面電荷總量接近為零）、高度親水性（無疏水作用位點）、足夠多可利用的化學基團、適當的表面積和孔徑、較高的理化穩定性等特點。一般情況下，決定親和吸附總效率的主要因素是載體的特異性、吸附容量和穩定性，這三個因素的相對重要性依純化的目的和規模不同而異。
隨著高分子材料以及成型加工工藝學的不斷發展，為親和膜分離技術提供了許多不同形狀、不同化學組成的膜組件，如平板膜、疊合平板膜和中空纖維膜。這些膜所用的基質主要分兩大類：一類是天然高分子材料，如纖維素及其衍生物；另一類是人工合成高分子材料，如聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚碸（PS）、聚丙烯睛（PAN）、聚乙烯醇（PVA）等。
配基的偶聯
為了製備親和膜，配基應與膜材料進行共價結合。有許多活化方法及偶聯技術可供使用，如：嗅化氰法（CNBr）、環氧法、高碘酸鈉法、二乙烯碸法及2-氟-1- 甲基吡啶瓮-4-磺酸鹽法（FMP）等，人們可以根據不同的膜材料選擇一種較為合適的活化方法。
結構形式
親和膜按照形狀可分為板式、圓盤式、中空纖維式，其中，前兩者統稱為平板親和膜：
①平板親和膜可將膜片堆疊起來製成膜柱或膜堆，具有上下均一、結構簡單、成本低等優點，但存在填充密度小、放大時操作壓將大等缺點。
②中空纖維親和膜可製成填充密度較大的膜堆，放大時也不存在壓降大幅度變化的問題，便於實現連續、自動、規模化操作；但由於在膜管軸向和徑向上存在流速分布，流速不同會導致親和吸附不均勻。
實現膜上親和分離需要解決的幾個關鍵問題：
（1）膜表面要有足夠多並可利用的化學基團（一般為-OH，-NH2，-SH或-COOH基），使其能進行活化，接上合適的間隔臂和配基。
（2）要有足夠數量可利用的化學基團則必需有足夠高的表面積，要便於讓生物大分子自由地出入膜，必需有足夠大的孔徑。
（3）孔分布應窄而均勻，以獲得高的通透量和分離效能。
（4）為了實現快速分離，常要加壓操作，因此要求膜有一定的機械強度，能承受一定的壓力，長期使用不變形。
（5）親和膜要耐酸、耐鹼、耐高濃度的緩衝夜和有機溶劑。
技術特點
膜分離過程設備簡單，易於放大，成本低，分離速度快，可連續操作；而親和分離的選擇性和特異性較強。二者結合則兼具處理量大、選擇性強、易於放大等顯著優點。該技術不僅利用了生物分子的識別功能，可以分離低濃度的生物產品，而且由於膜的滲透通量大，因而能同時進行純化和濃縮。
與親和色譜相比，親和膜色譜的最大優勢在於其動力學方面，它克服了顆拉狀多孔載體擴散傳質阻力大的缺點，代之以對流傳質，這樣就可以在較低的操作壓和較高的流速下對目標蛋白進行快速的分離和純化，從而縮短操作時間、提高純化效率。另外，對配基量相等的膜柱與樹脂吸附柱，前者的生產速率遠遠大於後者，尤其是在高速進樣條件下。
操作方式
親和膜分離過程的操作方式分為死端過濾和錯流過濾，對平板膜和疊合平板膜多採用死端過濾，而對於中空纖維膜多採用錯流過濾模式。
套用領域
隨著生命科學和生物工程的迅速發展，對生物大分子純化分離的要求越來越高。對一些分子量相差很小的大分子就要用親和戒指所具有的特異性將其分離出來。目前，親和膜分離技術已套用於單抗、多抗、胰蛋白酶抑制劑的分離以及抗原、抗體、血清白蛋白、胰蛋白酶、干擾素等的純化。
親和膜分離技術的發展和成熟套用，極大地推動了熱敏物質（蛋白質、酶、維生素、中草藥等）和分子量相近物質（同分異構體、同系物等）分離技術的發展。
親和膜分離技術在以下方面得到廣泛套用：
① 蛋白質和酶的分離純化；
② 手性拆分對映異構體；親和膜中的配基可以選擇性的吸附對映異構體中的某一種，而對另外的不具有吸附性，用適當截留分子量的親和膜截留料液，實現對映異構體的分離，然後再用洗脫液將所需物質洗脫，從而得到分離純化的產品。
③ 測定單股核苷酸目標分子的鹼基序列；
④ 測定轉移酶活性。
