親和膜色譜

親和膜色譜又稱親和膜分離，其在生物大分子的分離純化中作為一種綜合性的技術出現在80年代末。親和膜色譜主要優點是克服了顆粒狀多孔載體擴散傳質阻力大的缺點，代之以對流傳質，這樣就可以在較低的操作壓和較高的流速下對目標物進行快速的分離和純化，從而縮短操作時間、提高純化效率。

基本介紹

• 中文名：親和膜色譜
• 外文名：Affinity Membrane Chromatography
• 性質：物理化學分析方法

定義

親和膜分離是將親和分離技術和膜分離技術結合，它將親和配基結合在分離膜上，利用膜作為基質，對膜進行改性，再按照吸附、清洗、洗脫和再生的順序，對生物產品進行分離純化。

親和膜材料

纖維素膜、聚醯胺膜、聚碸膜，聚烯烴膜；

聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、全氟聚合物等；

聚醚脲烷類膜和凝膠-纖維玻璃膜。

分離過程

親和膜是親和色譜及膜分離的結合，親和膜過程所採用的設備與膜分離所用類似，也是在膜組件如中空纖維組件、平板式組件等中進行，而其操作過程又類似於親和色譜將樣品混合物緩慢地通過膜，使其中與親和配基有特異性相互作用的分子和配基產生偶合，生成相應的配合物，然後再通過改變條件，如洗脫液組成、pH值、離子強度、溫度等，使己和配基產生相互作用的配合物分子解離，將其收集起來，再將膜進行洗滌、再生和平衡，以備下次分離用。

膜材料的選擇

理想的親和膜基質具有的特徵是高的孔隙率，大的內外表面積，高的化學、生物、機械穩定性，一定的親水性，低的非特異性吸附，存在可化學反應的基團，高結合容量，耐溶劑沖洗，成本低，重複性好。親和膜基質材料按來源大致可為天然聚合物和合成聚合物，目前研究較多的是纖維素膜、尼龍膜、聚礬膜，聚乙烯中空膜，另外一些可用做親和膜基質材料的還原聚羥乙基甲基丙烯酸酯、殼多糖、甘油基甲基丙烯酸酯與乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯醇、聚醚脲烷類聚合物、無機膜如玻璃中空纖維膜等。

分離膜的改性

基於在微孔濾膜或超濾膜上所具有的某些官能團，通過適當的化學反應途徑，將其改性，接上一個間隔臂，一般應是大於3個碳原子的化合物。

間隔臂的選擇

配基可以直接固定在基質材料上，但有時候空間效應會影響到配基與生物大分子的作用，這時就要考慮引入間隔臂分子，以提高配基的使用效率。最普遍的方法就是將通式為NH2(CH2)nR的ω-氨烷基化合物與基質偶連，然後在間隔臂上接上配基。一般認為，為了獲得最佳偶合作用，配基與膜之間必須插人至少一個亞甲基的橋。但如果生物大分子的表觀相對分子質量低或與固定配基的親和性高，則間隔臂長度不如在大蛋白或低親和系統中要求嚴格。最近又有提出採用親水性更強的間隔臂代替疏水間隔臂，能極大地降低非生物特異性吸附作用。

配基的選擇

配基是指底物、產物、抑制劑、輔酶、變構效應物或其它任何能特異地和可逆地與欲純化的蛋白質或大分子物質發生相互作用的分子。親和膜分離的機制就是利用配基與目標分子的特異性相互作用，因此，如果能找到合適的配基，原則上就能對目標物質進行分離了。配基按其來源可分為兩大類天然配基和人工合成的配基，按其特異性又可分為生物特異性配基和基團特異性配基。生物特異性配基是指利用自然界中特異性相互作用生物物質對之一做配基，如酶一底物、酶一抑制劑、激素五補接受體、抗體一抗原等。基團特異性配基是指對具有某一類基團或結構的生物大分子均有特異性作用的配基，如胺基酸、蛋白質A、活性染料、金屬鰲合離子等。

天然配基對於一定的生物分子具有內在的生物特異性吸附作用，而合成的配基則經常是通過變換及最佳化偶合和洗脫條件來實現其特異性作用。雖然從性能上說，天然配基要優於合成配基，但天然配基的製取和提純較困難，價格昂貴，而且它們對使用條件的要求也比較苛刻。因而，實際中用得更多的是量大而又相對便宜的配基，如生物活性染料，由於它可與多種脫氫酶、己糖激酶、鹼性磷酸酯酶、羧肽酶、白蛋白等結合，成為目前套用最廣的配基。近年來，以鰲合金屬離子為配基的固載化金屬親和色譜（IMAC）得到發展。IMAC的作用機理是：路易斯酸即鰲合的過渡金屬離子如Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)作為電子對供給者能和組氨酸、胱氨酸、色氨酸等電子接受體作用。因此，IMAC多用於從胺基酸混合物中分離出組氨酸以及考察蛋白質中的組氨酸殘基。相比其它基團特異性配基，IMAC在配基穩定性、容量、活性蛋白質的回收及成本上都比較優越。

親和膜的製備、活化及偶合

總體來說選用一個適合的親和配基，在一定條件下讓其與間隔臂分子產生共價結合，生成帶有親和配基的膜分離介質。

具體的親和膜的製備主要分為3步：成膜，功能化，活化，按它們進行的先後順序不同可分為以下幾種途徑

（1）膜材料→功能化的膜材料→功能化的膜→活化的膜

（2）膜材料→膜→功能化的膜→活化的膜

（3）膜材料→功能化的膜材料→活化的膜材料→活化的膜

功能化即通過引人適當的基團,使膜材料或膜改性。而活化則是使引人的基團活性增強，能與配基作用。

具體採用哪一種途徑更好，因材料而異，一般認為，活化在成膜後進行更好一些。成膜方法和一般的制膜方法一樣，主要是採用溶膠一凝膠轉化法，也可採用靜電紡絲法製得膜。

功能化的方法可以通過一般的化學反應，也可以通過輻射接技引人所需基團，或者在膜表面覆蓋一層帶基團的塗層。引入的基團（象經基、酞胺基團）多為親電性的，使膜更易於與配基或間隔臂上的親和基團反應。

膜的活化是指用一些雙官能團試劑與膜作用。常用活化法有溴化氰法、環氧法、羰基二咪法等。活化時應注意，通常活化和配基的偶契約時進行，而配基多為脆弱的生物分子，因此活化時間不能太長；此外配基的泄漏導致產品污染也應予以考慮，尤其是當親和膜用於分離醫藥製品時。理想的活化和偶合應該滿足：

（1）條件溫和，快速、高效並且無副作用地形成穩定的共價鍵；

（2）偶合完成後剩餘的活性基團可用簡單的方法封閉；

（3）所用試劑無毒、便宜，易於工業放大使用。

親和絡合

將樣品混合物緩慢地通過膜，使樣品中欲分離的物質與親和配基產生特異性相互作用，生成配基和配位物為一體的複合物，其餘不和膜上配基產生親和作用的物質則隨流動相通過膜流走。

洗脫

改變條件，如洗脫液的組成、pH值、離子強度、溫度等，使複合物產生解離，並將解離物收集起來，進一步處理。

親和膜再生

將解離後的親和膜進行洗滌、再生、平衡，以備下次分離操作時再用。

注意事項

操作時除要選擇適宜的加料速度和操作溫度外，洗脫方式的選擇、洗脫液的組成是分離成敗的一個重要因素。正確洗脫會進一步提高分離的純度。反之，甚至會使生物大分子變性失活。洗脫可分為特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫就是在洗脫液中加人對配基有更強親和力的物質，將目標蛋白質置換下來。而改變緩衝溶液中的鹽濃度、pH值、溫度等則屬於非特性洗脫。一般非特異性洗脫經濟些，但會導致純度下降。若所用的吸附特異性低，如使用基團特異性的配基，採用特性洗脫會提高最終產品的純度。

套用

蛋白質親和分離中常用的作用體系有抗原-單克隆抗體，激素-受體蛋白，核酸-核酸結合蛋白，酶-底物/產物/抑制劑/輔酶，免疫球蛋白-蛋白A/蛋白G，蛋白質-肝素/活性染料/過渡金屬離子/肽段等。

已報導的親和膜套用實例有很多。例如，陳歡林、李靜等採用低溫氧或氨電漿法改性聚丙烯中空纖維微孔膜，使膜表面產生了-OH、-COOH和C=O等極性基團，製備了Fe、Ni、Cu、Zn等金屬離子螯合親和膜，用於溶菌酶的分離，結果表明，Ni、Cu螯合膜對溶菌酶有較高的吸附量，在20 min和68 W的最佳條件下，製成的Cu離子膜對溶菌酶的平衡吸附量為8μg/cm2。螯合過程中採用氯化物鹽溶液製得的膜比採用硫酸鹽溶液製得的膜平衡吸附量要高。吸-脫附量衰減的問題可採用補充螯合離子的方法解決。美國Pall公司對聚醯胺微孔濾膜(孔徑0.2μm)進行了化學改性，在膜上鍵合了含氨基的活性染料配基，並固載了單克隆或多克隆IgG免疫球蛋白，所獲得的IgG純度更高些。Millipore公司已研製成功含蛋白A的中空纖維膜分離器，可用作單克隆抗體的化。Amerace公司研製了一種聚乙烯醇和矽膠共混的親和膜，在直徑為47 mm的碟式膜上可結合20 mg的牛血清蛋白。

優勢及趨勢

優勢

（1）以高分子膜材料為載體，極大地改善了蛋白質向配基的傳質。當溶液透過膜時，溶液中的目標蛋白質能和配基很快結合，充分利用了親和吸附快速、高效的特點，分離周期很短。對於大規模蛋白質分離來說，分離周期越短，原料的處理量越大，同時價格昂貴的配基的利用率也越高；

（2）親和膜具有良好的流體通透性和機械穩定性，可在高流速下操作，設備操作壓降低，易於放大；

（3）由於親和膜具有良好的流體通透性和機械穩定性，操作流速高，洗脫時間短。對於解離常數較小的親和系統（如抗原一抗體、激素一激素受體），可有效地保護配基和蛋白質的生物活性。

趨勢

親和膜是一新型分離方法，是目前分離技術研究的熱點之一。但是，與傳統的凝膠色譜柱相比，親和膜的吸附容量還不是太大，而且製造成本也較高。然而，隨著制膜技術的發展、新型配基的開發和配基偶聯技術的不斷完善，親和膜在大規模蛋白質（特別是基因工程蛋白質）分離純化方面必將發揮越來越大的作用。