基本介紹
- 中文名：血小板分離純化技術
- 必要前提：血小板的分離純化成
- 重要關係：它與出血與血栓性疾病
- 早期分離：根據血小板的物理屬性和生物屬性
分離技術,常用方法介紹,方法比較,先進分離技術,
分離技術
隨著科技的發展，細胞分離技術也不斷更新換代，早期的分離書主要是根據血小板的物理屬性和生物屬性，從90年代流式細胞術出現至今，湧現出一批先進的分離技術，以流式細胞術和免疫磁珠分選為代表，21世紀發展起來的細胞分離技術大多是利用細胞表面標誌進行分離的，這些技術依賴於針對細胞表面標誌單克隆抗體的研究水平。它們的出現使細胞的分離技術產生了實質性的進步。現對血小板分離純化技術發展過程中的代表性方法作一介紹及評價。
常用方法介紹
洗滌法
以5%EDTA抗凝的血樣在室溫下，以1500rpm/ 200g離心12分鐘，離心後上層為富血小板血漿，下層為壓積白細胞和紅細胞。將富血小板血漿轉入塑膠試管，3500rpm/1200g離心5min。棄去上層血漿，用血小板洗滌液洗滌3次。
梯度密度離心法
梯度密度離心法常用的分離液有Ficoll、Fercoll、戊糖等，Ficoll是最適合於分離細胞的分離液。Ficoll主要成分是一種合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。分離時先將分層液置試管底層，然後將抗凝全血以PBS稀釋疊加在分層液上面，水平式離心後，血小板因密度小而懸浮於上層，將上層液體吸出，用血小板洗滌液洗滌3次便可得到純化血小板。
凝膠過濾，又稱凝膠色譜、凝膠層析。該技術是建立在分子篩概念的基礎上的。一般常用的材料有葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯醯胺等。血小板純化常用的是牛血清瓊脂糖凝膠。該凝膠是一種交聯的聚合物，具有網路結構。將分離出來的富血小板血漿鋪加於凝膠表面。離心使其在凝膠柱中流濾。血小板只能沿凝膠顆粒間的空隙隨溶劑流動，不能進入凝膠顆粒內部，故租滯作用小，流程短，流動速度快而先流出凝膠柱。血漿蛋白則滲入凝膠顆粒網內，故租滯作用大，移動速度慢而較遲流出凝膠柱，從而達到純化血小板的目的。
方法比較
早期的血小板分離技術主要是根據血小板的物理屬性如密度等進行分離的，用2010年的標準看，其分離的靈敏度及解析度都不高，以離心為主要手段的分離方法僅能除去70%-95%的白細胞，且血小板損失量較大，一般血小板回收率為70%。而且，上述方法分離的血小板仍然存在一定量的血漿蛋白，當進行螢光分析或其它分析時，血漿蛋白的存在對實驗產生一定的干擾作用。另外，Bogdan Walkowiak等人用流式法對經上述三種方法分離的血小板表面P選擇素的表達進行檢測，發現經上述方法分離的血小板P選擇素的表達量與全血中血小板的表達量相比，均有不同程度的增加。洗滌法與梯度密度離心法分離的血小板的表達量是全血中的2倍多。結果表明，上述方法分離血小板過程對血小板存在影響，使部分血小板在分離過程中活化了。活化的血小板可以影響以後的實驗信息數據，甚至改變結果。由此可見，早期的分離方法存在著若干不可避免的問題。但是，由於上述方法簡便易行，不需要繁複的設備儀器，使其至今在眾多實驗室內仍然被廣泛套用著。如果僅作為初步血小板分選或血小板富集的手段來說，上述技術方法還是十分有效的。
先進分離技術
免疫磁珠分選技術
免疫磁珠分選技術（MACS）是高效簡捷的血小板分離純化方法。MACS是利用血小板表面標誌CD61進行分離的。將單克隆抗CD61-PE包被在磁珠上，然後包被上單克隆抗體的磁珠與血小板特異性結合。磁珠攜帶著與之結合的血小板吸附於分離柱上，沒有與磁珠結合的陰性細胞流出，從而實現了血小板的分離。
用MACS細胞分選系統可以分離出非常純的血小板，純度可以達到80%-99%，連續兩次過柱分選可進一步提高血小板純度，通常可大達95%-99%，回收率在90%以上。而且，由於微型磁珠的體積極小，其直徑只有50nm，所以不會對血小板造成機械性壓力，而且使孵育時間短，操作過程快。MicroBeads形成一個穩定的膠體液，它們在磁場中既不沉澱又不凝聚。微型磁珠的大和它的組成成分（氧化鐵和多糖）使其可被生物降解，且不會激活細胞或影響細胞的功能和活力，細胞的生理功能也不會改變。磁珠不需要去除，因此，陽性分選出的細胞可立即用於分析和隨後的實驗。如果操作得當，其分離效果與流式細胞術的血小板分離效果基本處於同一水平，並還具有比流式細胞儀的分離更省時，費用低，及操作簡單等優勢。
流式細胞術
