基本介紹
- 中文名：原位雜交
- 外文名：in situ hybridization
基本定義,例子,將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上,菌落的裂解及DNA結合於硝酸纖維素濾膜,套用,意義,原位雜交試驗,原位雜交第一天,原位雜交第二天,原位雜交第三天,螢光原位雜交,
基本定義
RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中鹼基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合（雜交），所形成的雜交體 (Hybrids）經顯色反應後在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術 經不斷改進，其套用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已 成為最有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向。
FISH是原位雜交技術大家族中的一員，因其所用探針被螢光物質標記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末 被發明，現已從實驗室逐步進入臨床診斷領域。基本原理是螢光標記的核酸探針在變性後與已變性的靶核酸在退火 溫度下復性；通過螢光顯微鏡觀察螢光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA螢光標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。螢光標記探針不對環境構成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮 短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。
例子
以菌落原位雜交為例：
對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可採用該方法。將這些菌落歸併到一個瓊脂主平板以及已置於第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間後，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存於4℃直至得到篩選結果。
將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上
（1） 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
（2） 用無菌牙籤將各個菌落先轉移至濾膜上，再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種（或打點）。每菌落應分別劃線於兩個平板的相同位置上。最後，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322）的菌落。
（3） 倒置平板，於37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
（5） 用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放於4℃，直至獲得雜交反應的結果。
（6） 裂解細菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結合於硝酸纖維素濾膜。
菌落的裂解及DNA結合於硝酸纖維素濾膜
（1） 在一張保鮮膜上製作一個裝有0.5mol/L NaOH的小窪（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小窪上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留於原處2-3分鐘。
（2） 用乾紙巾從濾膜的下方吸乾濾膜，用一張新的保鮮膜和新配製的0.5mol/L NaOH重複步驟（1）。
（3） 吸乾濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鮮膜窪上。5分鐘後吸乾濾膜，再重複一次該步驟。
（4） 吸乾濾膜，把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鮮膜小窪上5分鐘後吸乾濾膜，轉移到一張乾的濾紙上，置於室溫20-30分鐘，使濾膜乾燥。
（5） 將濾膜夾在兩張乾的濾紙之間，在真空烤箱中於80℃乾烤2小時，固定DNA。
（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。
3.雜交 （1） 盛有2×SSC的塑膠盤同，將乾烤的濾膜飄浮在液面上，徹底浸濕5分鐘。
（2） 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放於溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到位於培養箱內的旋轉平台上。於50℃處理30分鐘。在這一步及以後的所有步驟中，應緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起。
（3） 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
（5） 將32 P標記的雙鏈DNA探針於100℃加熱5分鐘，迅速置於冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
（6） 雜交結束後，去除雜交液，立即於室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，並將濾膜至少翻轉一次。重複洗 一次，同時應避免膜乾涸。
（7）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液於68℃將濾膜浸泡60分鐘。
（8） 把濾膜放在紙巾上於室溫晾乾後，把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上，並在保鮮膜上作幾個不對稱的標記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
（9） 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片並加上增感屏於-70℃曝光12-16小時。
套用
①細胞特異性mRNA轉錄的定位，可用於基因圖譜，基因表達和基因組進化的研究；
②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和巨細胞病毒DNA的檢測；
④基因在染色體上的定位；
⑤檢測染色體的變化，如染色體數量異常和染色體易位等；
意義
原位雜交：在研究DNA分子複製原理的基礎上發展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點，套用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、螢光素生物素、地高辛等非放射性物質）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然後可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在並定位；用原位雜交技術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。
原位雜交試驗
收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時後用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然後換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯鋶脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成）
原位雜交第一天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。
2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重複一次
4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與後固定（本實驗不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏鬆組織，以便於雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預雜交
1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振盪。
2）用等體積的HYB+取代HYB－。
3）60℃水浴，預雜交4小時以上。
3. 雜交
1）吸去預雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..
2）60℃ 溫浴過夜。
註：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。
原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放於－20C保存（通常探針可重複使用十次左右）。
2）加入50%甲醯胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重複一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重複一次。
2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰櫃過夜。
原位雜交第三天
1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然後用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，最後用1mlMABT溶液置換，25分鐘。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色。
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次後加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰櫃保存。
原位雜交中溶液的配製：
PBS:
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調PH值至7.4
抽濾，滅菌
4% 多聚甲醛：
多聚甲醛 40g
PBS 1L
加熱持續攪拌至溶液澄清。-20℃保存
PBST：
PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:
Na3Citrate 2H2O 88.2g
NaCl 175.5g
DEPC H2O 至1L
抽濾，滅菌
SSCT：
SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：
甲醯胺：20XSSC儲液：DEPC水=2：1：1配製
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存。
HYB+：
HYB- 20ml
yeast RNA 10mg
heparin 1mg。
-20℃保存。
MAB：
maleic acid 11.6g
NaCl 8.8g
用固體NaOH（約7g）調至Ph=7.5
4℃保存
MABT
MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.
10% blocking reagent:
blocking reagent 8g
MAB 72ml
1：2：7溶液：
滅活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7
用時現配
Staining buffer：
Tris 12.1g
pH9.5
Mgcl 6H2O 10.2g,
Nacl 5.85g
Tween-20 1ml,
用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM。
螢光原位雜交
螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以螢光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子（reporter molecule）結合，雜交後再通過免疫細胞化學過程連線上螢光染料[1,2].FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然後將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與螢光素分子偶聯的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點，不但能顯示中期分裂相，還能顯示於間期核.同時在螢光原位雜交基礎上又發展了多彩色螢光原位雜交技術和染色質纖維螢光原位雜交技術.
