在較高等的真核生物中，有一類特殊的調控序列(啟動子等)可以調控基因只能在一定的組織中才進行有效的表達。選用這樣的調控序列可以構建一系列組織特異性表達載體，為研究動植物發育和人類基因治療等提供了有效的手段。目前已構建的組織特異性表達載體有乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、神經組織特異性表達載體、花葯特異性表達載體和種子特異性表達載體等。
基本介紹
- 中文名：組織特異性表達載體
- 外文名：tissue-specific expression vector
- 存在生物：較高等的真核生物
- 本質：基因載體
- 特點：基因只能在一定的組織才有效表達
- 舉例：乳腺組織特異性表達載體
幾種特殊用途的克隆載體,啟動子探針載體,誘導型表達載體,組織特異性表達載體,反義表達載體,組織特異性表達載體的構建,組織特異性啟動子與質粒DNA的酶切及回收,組織特異性啟動子與載體DNA片段的連線,
幾種特殊用途的克隆載體
啟動子探針載體
啟動子是調控基因有效轉錄的必備元件，是構建基因表達載體的重要組成部分，在研究生物發育機制、提高目的基因表達產量和進行基因治療等方面起著重要的作用。分離不同類型基因啟動子已成為基因工程的重要任務之一，而啟動子探針(promoter probe)載體則是一種有效、經濟、快速分離基因啟動子的工具。啟動子探針載體除了質粒載體必備的元件外，還必須含有檢測部件。檢測部件有兩部分組成，即一個已失去啟動子且易於檢測的遺傳標記基因以及克隆位點。目前用作檢測遺傳標記基因主要有抗生素抗性基因和綠色螢光蛋白基因等。
誘導型表達載體
誘導型表達載體指啟動子必須在特殊的誘導條件下才有轉錄活性或比較高的轉錄活性的表達載體。外源基因處於這樣的啟動子下，必須在合適的誘導條件下才能表達。採用這種表達載體獲得的轉基因生物便於人工控制，即使進入自然環境中，由於不存在合適的誘導條件，因此不能表達外源基因產物，也不會導致環境污染和影響生態系統的平衡。可以認為這是一類較安全的基因表達載體，並且鑒於誘導表達載體能人為地控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床套用及基礎研究提供良好的手段。目前用作誘導型的啟動子有二價金屬離子誘導啟動子、紅光誘導啟動子、熱誘導啟動子和乾旱誘導啟動子等。
組織特異性表達載體
在較高等的真核生物中，有一類特殊的調控序列(啟動子等)可以調控基因只能在一定的組織中才進行有效的表達。選用這樣的調控序列可以構建一系列組織特異性表達載體，為研究動植物發育和人類基因治療等提供了有效的手段。目前已構建的組織特異性表達載體有乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、神經組織特異性表達載體、花葯特異性表達載體和種子特異性表達載體等。
反義表達載體
反義核酸技術是目前人工干預基因表達的一項重要技術，它利用人工合成或重組的與靶基因互補的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結合，達到封閉其表達的目的。此技術已成為基因治療的重要手段，其中構建反義表達載體就可以在靶細胞內直接產生致病基因的反義RNA片段。將獲得的致病基因反向組入表達載體，即可構建成反義表達載體。當反義表達載體導入靶細胞後，就可轉錄出與致病基因mRNA互補的反義RNA，特異性地封閉致病基因的表達。
組織特異性表達載體的構建
組成型啟動子控制下的外源基因在受體植物的所有組織和所有發育階段都會表達。外源基因在受體植物內持續、高效的表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態發生改變，影響植物的生長發育。而組織特異性啟動子則能調控基因在植物特定組織和特定發育階段表達，不僅使外源基因在植物體內發揮有效的作用，同時也可減少對植物的不利影響，因而組織特異性表達載體的構建在基因工程中具有重要的套用價值。
構建組織特異性表達載體，通常的方法就是用組織特異性啟動子替換掉原有表達載體中的組成型啟動子。其具體操作首先是對原有的表達載體的質粒DNA進行酶切，切除其中的組成型啟動子，再與需要的組織特異性啟動子連線，讓組織特異性啟動子連線到原有載體中組成型啟動子的位置從而得到所需的特異性表達載體。
組織特異性啟動子與質粒DNA的酶切及回收
1、儀器設備
(1)離心機。
(2)水浴鍋。
(3)移液槍。
(4)瓊脂糖凝膠電泳系統。
(5)微量分光光度計。
2、實驗試劑
(1)限制性內切酶及相應緩衝液。
(2)瓊脂糖、0.5×TBE緩衝液、上樣緩衝液、DNA標記。
(3)DNA回收試劑盒。
3、實驗步驟
(1)為了使組織特異性啟動子能順式連線到表達載體上，選取兩種適當的限制性內切酶消化組織特異性啟動子片段和載體。在A、B兩個離心管中分別依次加入以下試劑，如圖1。
圖1
圖1(2)混勻後，瞬時離心，在37℃條件下保溫3 h。在65℃條件下保溫10 min滅活限制性內切酶。加入適量的上樣緩衝液，混勻後離心，上樣於1%的瓊脂糖凝膠的兩個樣品槽中，並在旁邊樣品槽中加入DNA標記，作為酶切片段大小的參考。
3 V/cm電泳1～2 h。
(3)紫外光下對照DNA標記條帶位置，選取目標條帶，分別回收。按DNA回收試劑盒說明進行DNA的回收。對回收得到的組織特異性啟動子DNA和載體DNA進行濃度測定。
4、操作要點
(1)取限制性內切酶時應使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時應儘量縮短限制性內切酶在室溫下的放置時間。
(2)反應混合物混勻時，應避免強烈振盪，以防止限制性內切酶變性並保證DNA大分子的完整。
(3)反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附於管壁上的液滴全部沉至管底。
(4)終止酶反應可根據需要採用以下不同的方法：
①酶切後不需進行下一步反應，可加入含EDTA的終止液終止反應。
②若需進一步反應(如連線，切割等)，可將反應管在65℃條件下保溫20～30 min，以滅活酶，終止反應。
③可用酚一氯仿抽提和乙醇沉澱。
組織特異性啟動子與載體DNA片段的連線
1、儀器設備
(1)離心機。
(2)水浴鍋。
2、實驗試劑
T4 DNA連線酶及其緩衝液。
3、實驗步驟
(1)在1.5 mL離心管中加入以下試劑：雙蒸水12 μl，組織特異性啟動子片段4 μl，載體DNA 1 μl，10×連線酶緩衝液2 μl，T4 DNA連線酶(1 U/μl)1 μl。總體積20 μl。
(2)混勻後瞬時離心。
(3)在16℃條件下連線4～16 h。
(4)檢測連線產物或直接用於轉化。
4、操作要點
(1)連線反應中需要ATP的參與，一般在連線酶緩衝液中含有ATP，如不含ATP，則需另加ATP至終濃度為1 mmol/L。
(2)不同廠家的T4 DNA連線酶活力單位及酶反應條件(反應緩衝液、反應溫度、反應時間等)不完全相同，使用時要注意。
