反義核酸技術是目前人工干預基因表達的一項重要技術，它利用人工合成或重組的與靶基因互補的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結合，達到封閉其表達的目的。此技術已成為基因治療的重要手段，其中構建反義表達載體就可以在靶細胞內直接產生致病基因的反義RNA片段。將獲得的致病基因反向組入表達載體，即可構建成反義表達載體。當反義表達載體導入靶細胞後，就可轉錄出與致病基因mRNA互補的反義RNA，特異性地封閉致病基因的表達。
基本介紹
- 中文名：反義基因表達載體
- 外文名：anti-sense expression vector
- 本質：基因載體
- 技術手段：反義核酸技術
- 套用：基因治療等
- 基因治療特點：特異性地封閉致病基因的表達
幾種特殊用途的克隆載體,啟動子探針載體,誘導型表達載體,組織特異性表達載體,反義表達載體,反義RNA技術,
幾種特殊用途的克隆載體
啟動子探針載體
啟動子是調控基因有效轉錄的必備元件，是構建基因表達載體的重要組成部分，在研究生物發育機制、提高目的基因表達產量和進行基因治療等方面起著重要的作用。分離不同類型基因啟動子已成為基因工程的重要任務之一，而啟動子探針(promoter probe)載體則是一種有效、經濟、快速分離基因啟動子的工具。啟動子探針載體除了質粒載體必備的元件外，還必須含有檢測部件。檢測部件有兩部分組成，即一個已失去啟動子且易於檢測的遺傳標記基因以及克隆位點。目前用作檢測遺傳標記基因主要有抗生素抗性基因和綠色螢光蛋白基因新，等。
誘導型表達載體
誘導型表達載體指啟動子必須在特殊的誘導條件下才有轉錄活性或比較高的轉錄活性的表達載體。外源基因處於這樣的啟動子下，必須在合適的誘導條件下才能表達。採用這種表達載體獲得的轉基因生物便於人工控制，即使進入自然環境中，由於不存在合適的誘導條件，因此不能表達外源基因產物，也不會導致環境污染和影響生態系統的平衡。可以認為這是一類較安全的基因表達載體，並且鑒於誘導表達載體能人為地控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床套用及基礎研究提供良好的手段。目前用作誘導型的啟動子有二價金屬離子誘導啟動子、紅光誘導啟動子、熱誘導啟動子和乾旱誘導啟動子等。
組織特異性表達載體
在較高等的真核生物中，有一類特殊的調控序列(啟動子等)可以調控基因只能在一定的組織中才進行有效的表達。選用這樣的調控序列可以構建一系列組織特異性表達載體，為研究動植物發育和人類基因治療等提供了有效的手段。目前已構建的組織特異性表達載體有乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、神經組織特異性表達載體、花葯特異性表達載體和種子特異性表達載體等。
反義表達載體
反義核酸技術是目前人工干預基因表達的一項重要技術，它利用人工合成或重組的與靶基因互補的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結合，達到封閉其表達的目的。此技術已成為基因治療的重要手段，其中構建反義表達載體就可以在靶細胞內直接產生致病基因的反義RNA片段。將獲得的致病基因反向組入表達載體，即可構建成反義表達載體。當反義表達載體導入靶細胞後，就可轉錄出與致病基因mRNA互補的反義RNA，特異性地封閉致病基因的表達。
反義RNA技術
反義基因技術(antisense technique)是20世紀80年代發展起來的一項基因表達調控技術，它為植物基因工程在農業上及相關產業上的套用開闢了廣闊的前景。
(1)反義基因技術的基本概念和原理
所謂反義RNA(antisense RNA)是指有義(sense)DNA鏈轉錄成的、與特異的靶RNA互補結合併能抑制靶RNA表達的一段序列。轉錄產生反義RNA的基因稱之為反義基因(antisense gene)。所謂反義RNA技術是指把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動子和終止子之間，然後把此基因構建體轉化到受體細胞中去(通常膿桿菌轉化的方法)，通過選擇培養獲得轉化生物體的技術。
反義基因轉錄生成的mRNA可以抑制具有同源性的內源基因的表達，用這種方法可獲得特定基因表達受阻而其他基因表達不受影響的轉基因植株。
反義基因表達載體的構建方法：第一步，以分離得到的mRNA為模板，合成反義DNA；第二步，以此反義鏈為模板合成有義DNA鏈；第三步，以細菌質粒(DNA)為載體，用限制性內切酶在靠近啟動子處切割一缺口；第四步，將有義DNA插入表達載體的缺口中，即得到一表達質粒，如果啟動子開始轉錄，表達載體即轉錄原來的mRNA；如果將插入的表達載體用限制性內切酶切割後，以相反的方向插入載體DNA環即表達載體轉錄形成反義RNA。
一般認為，在原核細胞中反義RNA與靶RNA具有特異互補性，反義RNA通過枕配對結合的方式在複製(replicate)、轉錄(transcropt)、翻譯(translation)等過程中對目的基因起著負調控作用，但詳細的機制還不清楚。在真核生物中尚未找到天然存在的反義RNA，但有一些小RNA分子可能起類似反義RNA的作用，反義RNA在真核細胞中的作用機制目前尚不清楚。研究發現，不僅與靶RNA 5’端互補的反義RNA有抑制作用，而且與3’端互補的反義RNA也有抑制作用，反義RNA在真核細胞中的抑制作用具高度的專一性。進一步研究認為反義RNA或DNA形成的RNA—DNA或DNA—DNA雜鏈，或抑制翻譯起始，或抑制RNA多聚體上的翻譯，或抑制從核內向胞質的轉運，從而抑制目的基因在生物體內的表達。
(2)反義基因技術的特點
經過20多年的研究和套用發現，反義基因技術有許多特點使其能夠很好地套用於實踐，總結起來有以下幾點。
①反義RNA可以高度專一地調節某一特定基因的表達，不影響其他基因的表達。反義基因的不同區段抑制效率不同，基因的部分片段(小至41 bp)就可起到抑制效果，抑制程度理論上從0～100%，這不同於基因的完全致死抑制，因此可從轉基因個體中篩選到所需要的基因型。
②轉化到植物中的反義RNA的作用類似於遺傳上的缺陷型，表現為顯性。所以被轉化的植物材料不必為純合體就可表現相應的性狀，從而避免了二倍體內等位基因的顯隱性干擾。
③反義基因整合到植物的基因組中可獨立表達和穩定遺傳，後代符合孟德爾遺傳規律。
④反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋白質結構，可省去對基因產物的研究工作。
⑤反義基因不改變目的基因的結構，在套用上更加安全。
(3)反義基因技術的套用
反義基因技術已經是相對比較成熟的技術，利用反義基因技術人為地控制生物體內某些基因的表達是植物基因工程中有巨大套用前景的研究。世界上第一個基因工程商業化園藝產品，就是利用反義基因技術將反義PG基因轉入番茄而得到的耐貯運的番茄。
美國Colgene公司研製的轉PG基因番茄FLAVAR、SAVRTM在美國通過美國藥物與食品管理局認可，在1994年5月21日推向市場，成為第一個商業化的轉基因食品。利用反義基因技術得到的反義PG番茄具有許多明顯的經濟價值，如果實硬度較大、耐貯運，同時果實采後的貯藏期可延長l倍，可大大減少因過熟和腐爛所造成的損失。可以說，反義基因技術為食品生物技術的發展開闢了廣闊的套用前景。
