甲醇酵母表達系統

甲醇酵母表達系統

甲醇酵母基因表達系統是一種最近發展迅速的外源蛋白質生產系統。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母,主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種,其中Pichia Pastoris作為基因表達系統使用得最多、最廣泛[1]。與以往的基因表達系統相比,它具有無可匹敵的高表達特性,已被認為是最具有發展前景的生產蛋白質的工具之一。

基本介紹

  • 中文名:甲醇酵母表達系統
  • 屬於:外源蛋白質生產系統
  • 可以:利用甲醇作為唯一碳源的酵母
  • 種類:H.Polymorpha、Candida Bodinii
高效表達特性,關鍵因素,表達載體,受體菌,套用前景,

高效表達特性

已有多種蛋白質的基因在該表達系統中克隆成功,包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。儘管各種外源蛋白質產生的水平不一,但各種蛋白質在甲醇酵母中的產生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統中產量的10~100倍[2]。如表皮生長因子EGF)在釀酒酵母中的產量為7.4mg/L,而在甲醇酵母中為450mg/L,提高了60倍[3]。椐報導,外源蛋白質在甲醇酵母中的產量最高可達12g/L[9]。

關鍵因素

表達載體

首先,甲醇酵母中沒有穩定的質粒,所以其表達載體採用整合型質粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉錄終止子(3′AOX1)構建成整合型表達載體。PAOX1是一個極強的啟動子,醇氧化酶的產量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質的30%[2],所以能使外源蛋白質在它的控制下高效產生。其次,在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導肽序列(α因子)構建分泌型載體,一方面可以減輕宿主細胞的代謝負荷,另一方面可以減少宿主細胞蛋白水解酶對外源蛋白質的降解,pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外,使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體,形成多個表達單元,產生高產的菌株,此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。

受體菌

在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時,甲醇酵母中AOX1基因的表達受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時,誘導基因表達,使外源蛋白質的產量更高。甲醇酵母適合高密度連續培養的條件,細胞乾重達100g/L以上,蛋白質產量極高[14]。受體菌採用蛋白水解酶缺陷型,從而大大降低產物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。

套用前景

經過近幾年的發展完善,甲醇酵母表達系統已日趨成熟,套用也日趨廣泛。國內已有多篇在甲醇酵母中生產外源蛋白質成功的報導。美國Invitrogen公司也已開發出多種新型的甲醇酵母表達系統試劑盒,如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等,利用甲醇酵母表達系統克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進一步深入,它在生產外源蛋白質方面將日益展示出誘人的前景。

相關詞條

熱門詞條

聯絡我們