基本介紹
- 中文名：巴斯德畢赤酵母表達系統
- 外文名：Pichia pastoris
- 功能：生產單細胞蛋白
- 時間：八十年代
簡介,畢赤酵母表達系統的特點,巴斯德畢赤酵母的載體,載體構建方法,巴斯德畢赤酵母表達菌株的培養條件,巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白表達,
簡介
八十年代巴斯德畢赤酵母曾被用於生產單細胞蛋白（SCP），有很好的發酵基礎，菌體密度可達100g/L乾重。其生長培養液的組分包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價而無毒。它能在以甲醇為唯一碳源的培養基中快速生長，其中醇氧化酶AOX——甲醇代謝途徑的關鍵酶可達細胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養細胞中則檢測不到AOX。AOX的合成是在轉錄水平調控的。其基因啟動子具有明顯的調控功能，可用於調控外源基因的表達。此調控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導雙重機制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中處於非表達狀態，而在培養液中加入甲醇後，外源基因即被誘導表達。巴斯德畢赤酵母中存在著一種稱為微體的細胞器，其中大量合成過氧化物酶，因此也稱為過氧化物酶體。合成的蛋白質貯存於微體中，可免受蛋白酶的降解，且不對細胞產生毒害。
畢赤酵母表達系統的特點
自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主表達外源蛋白以來,作為一種新的高效的表達系統，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報導的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，與其它表達系統相比，畢赤酵母表達系統具有以下優勢：
2）表達水平高，即可在胞內表達，又可分泌型表達。畢赤酵母中，報導的最高表達量為破傷風毒素C為12g/l，一般大於1g/l。絕大多數外源基因比在細菌、釀酒酵母、動物細胞中表達水平高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有指導分泌的信號肽序列，使表達的外源目的蛋白分泌到發酵液中，有利於分離純化；
3）發酵工藝成熟，易放大。已經有大規模工業化高密度生產的發酵工藝，且細胞乾重達100g/l以上，表達重組蛋白時，已成功放大到10000升；
與其他表達系統比較
甲基酵母部分優點 | 與其他真核表達系統比較 | 與原核表達系統比較 |
1.屬於真核表達系統，具有一定的蛋白質翻譯後加工，有利於真核蛋白的表達優點 | - | + |
2.AOX強效啟動子，外源基因產物表達量高，可以達到每升數克表達產物的水平 | +++ | + |
3.酵母培養、轉化、高密度發酵等操作接近原核生物，遠較真核系統簡單，非常適合大規模工業化生產。 | +++ | = |
4.可以誘導表達，也可以分泌表達，便於產物純化。 | = | + |
5.可以甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業產物替代葡萄糖作為碳源，生產成本低 | +++ | + |
+ 表示優勝於；- 表示不如；= 表示差不多
產品性能：
優點——使用簡單，表達量高，His-tag便於純化
缺點——酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題
巴斯德畢赤酵母的載體
是整合型載體。常見的表達載體有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及3'AOX1區。當整合型載體轉化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。
載體構建方法
與建立釀酒酵母基因工程表達系統類似，構建巴斯德畢赤酵母表達菌株的基本方法如下：
(1)經典遺傳學操作方法（如突變體分離、互補分析、回交和單孢分析）；
(2)分子遺傳學方法（如DNA轉化、基因置換等。）為了獲得高穩定的外源蛋白表達菌株，巴斯德畢赤酵母表達載體連同外源基因通過同源重組整合至宿主染色體基因組座位上。與自主複製的質粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種。一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉化子中進行自然篩選。得到產量高的表達菌株。另一種在轉化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而後再通過交換整合到受體染色體上。在發酵罐培養的產物選擇壓力下此兩種方式獲得的多拷貝表達菌株被證明是穩定的。
經同一表達載體轉化後分離得到的不同轉化子，其產物的表達水平不同。即使受體染色體上重組了相同數目的表達盒。轉化子的表達情況也不近相同。因此，為了獲得高產量的表達菌株，需要對大量的轉化子進行篩選。小量搖瓶培養無疑是篩選轉化子簡便而有效的方法。但是由於在搖瓶培養中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發酵罐培養條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養條件，使其產物的表達量與預期的發酵罐培養結果相近。
巴斯德畢赤酵母表達菌株的培養條件
包括：適宜的培養液緩衝系統及適當的發酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通氣量；添加適量的蛋白腖或酪蛋白水解物以避免產物被蛋白酶降解並為外源蛋白的合成及分泌提供胺基酸和能量。在甘油作碳源的培養液中，細胞迅速生長，菌體密度逐漸增大，但此時外源基因的表達被完全抑制。而當甘油缺失或被完全消耗時，甲醇被添加到培養液中，誘導產生外源蛋白。此階段菌群生長遲緩，但產物表達旺盛。
