釀酒麥牙汁目前已發展和建立的釀酒酵母表達載體既有整合性載體又有附加體型酵母.套用於釀酒酵母的附加體型表達載體多為大腸桿菌—釀酒酵母穿梭表達質粒,此載體可在細菌宿主中進行選擇和增殖,常使用pUC質粒的複製起點和氨甲苄青黴素抗性選擇標記.酵母部分通常包括酵母的2um質粒的複製區,用於酵母轉化的選擇元件主要是營養缺陷型相關的基因.這類載體能獨立於酵母染色體之外複製,常以30或更多拷貝存在,但沒有選擇壓力時不穩定.
基本介紹
- 中文名：釀酒麥牙汁
飲料介紹,優點,缺點,
飲料介紹
釀酒麥牙汁這種類型表達載體在細胞中必須有選擇壓力才能穩定表達,不適於工業化生產,但是對於科學研究中利用酵母重組體系對外源基因進行定向進化時,可簡單地通過抽提質粒而獲得突變基因.另一類載體沒有在酵母中複製的質粒複製區,而是利用同源片斷將載體整合到染色體上,這類染色體穩定性高,但拷貝數低.於附加型載體一樣,該類載體也有用於酵母轉化的選擇元件和原核生物部分的複製起始序列以及某種抗生素抗性基因.
釀酒麥牙汁
釀酒麥牙汁在表達時,外援基因與來自釀酒酵母的高效表達基因啟動融合,這些啟動子既有組成型表達,也有誘導型表達.目前通過兩種方式提高拷貝數:(1)用酵母轉座子以產生多個插入拷貝;(2)通過rDNA介導的重組插入到核糖體DNA簇中,在宿主的染色體上以約150個串聯重複序列存在.釀酒酵母表達系統也有其不足之處,主要是:(1)較難進行高密度發酵,因為其發酵時會產生乙醇,乙醇的積累會影響酵母本身的生長;(2)蛋白質的分泌能力較差.二常用酵母的表達系統1釀酒酵母表達系統釀酒酵母的基因表達系統最為成熟,包括轉錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH,磷酸甘油激酶基因PKG,乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子,多種重組外源蛋白獲得成功表達.釀酒酵母表達系統的最大問題在於其超糖基化能力,往往使得有些重組蛋白(如人血清白蛋白等)與受體細胞緊密結合,而不能大量分泌.這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統來彌補.2巴斯德畢赤酵母表達系統巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養菌,能在低廉的甲醇培養基中生長,甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達,因此生長迅速,乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子,表達的可誘導性是巴斯德畢赤酵母表達系統的三大優勢.由於巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主複製型載體,所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上.在此情況下,外源基因的高效表達在很大程度上取決於整合拷貝數的多寡.目前已有20餘種具有經濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統中獲得成功表達.甲醇酵母表達系統具有以下優點:(1)啟動子強並受甲醇嚴格誘導,因此可用於調控外源蛋白的表達.(2)作為真核表達系統,能對重組蛋白進行翻譯後必要的剪接,摺疊和修飾,糖基化也更接近高等真核生物甚至人類.(3)甲醇酵母在轉化,基因轉換,基因替換,基因敲除等基因操作技術上與釀酒酵母相似,簡單易行,但是外源蛋白的表達量卻比釀酒酵母增加了10—100倍.(4)重組菌的遺傳性質穩定,表達量和分泌效率高,適於大規模發酵.(5)能在無機鹽培養中迅速生長,易進行工業化生產,高密度培養幹細胞量可達100g/L以上.在巴斯德畢赤酵母中有2個基因(AOX1AOX2)編碼QOX,約占全部可溶性蛋白質的30%以上,基因嚴格的受甲醇的誘導和調控.
優點
(1)載體的發展
由於巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加體質粒,所以一般用整合型質粒作為外源基因的表達載體.整合為點一般位於組氨醇脫氫酶編碼基因HIS4區或AOX1區,典型的巴斯德畢赤酵母表達載體含有乙醇氧化酶基因5'AOX1啟動子,3'AOX1終止子,其中還有供外源基因插入的多克隆位點,以HIS4基因作為互補選擇標記或抗Zeocin作為抗性選擇標記.
(2)受體菌常用畢赤酵母宿主菌主要有GS115和KM71,均為HIS4突變型
(3)轉化方式巴斯德畢赤酵母的轉化方法有原生質體法,電激法,氯化鋰法和PEG法等.
(4)整合方式黨政和載體轉化受體菌時,它有3種整合方式.一是5'AOX1和3'AOX1能與染色體發生同源重組,使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因;二是染色體AOX1區與載體質粒的AOX1區發生單位點互換;三是染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發生置換.
(5)獲得高拷貝數整合轉化子的方法
(6)表達菌株的培養條件
(7)提高外源基因在甲醇酵母中表達的注意事項1,外源基因中A,T含量,許多高A+T含量的基因常會由於提前終止而不能有效轉錄2,密碼子是否符合甲醇酵母的偏好性,在所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的,對這些偏好密碼子的使用程度和基因表達水平成正比3,mRNA5'非凡疫區的核苷酸序列和長度會影響到核糖體40S亞單位對mRNA的識別;4,選取合適的宿主菌5,產物自身的穩定性6,甲醇酵母液體深層發酵時的培養條件是否合適.
由於巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加體質粒,所以一般用整合型質粒作為外源基因的表達載體.整合為點一般位於組氨醇脫氫酶編碼基因HIS4區或AOX1區,典型的巴斯德畢赤酵母表達載體含有乙醇氧化酶基因5'AOX1啟動子,3'AOX1終止子,其中還有供外源基因插入的多克隆位點,以HIS4基因作為互補選擇標記或抗Zeocin作為抗性選擇標記.
(2)受體菌常用畢赤酵母宿主菌主要有GS115和KM71,均為HIS4突變型
(3)轉化方式巴斯德畢赤酵母的轉化方法有原生質體法,電激法,氯化鋰法和PEG法等.
(4)整合方式黨政和載體轉化受體菌時,它有3種整合方式.一是5'AOX1和3'AOX1能與染色體發生同源重組,使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因;二是染色體AOX1區與載體質粒的AOX1區發生單位點互換;三是染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發生置換.
(5)獲得高拷貝數整合轉化子的方法
(6)表達菌株的培養條件
(7)提高外源基因在甲醇酵母中表達的注意事項1,外源基因中A,T含量,許多高A+T含量的基因常會由於提前終止而不能有效轉錄2,密碼子是否符合甲醇酵母的偏好性,在所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的,對這些偏好密碼子的使用程度和基因表達水平成正比3,mRNA5'非凡疫區的核苷酸序列和長度會影響到核糖體40S亞單位對mRNA的識別;4,選取合適的宿主菌5,產物自身的穩定性6,甲醇酵母液體深層發酵時的培養條件是否合適.
缺點
1、釀酒麥牙汁1分子生物學的研究基礎差,要對其進行遺傳改造困難較大
2、不是一種食品微生物,發酵時又要添加甲醇,所以,要用它來生產藥品或食品還沒有被廣泛接受.
3、發酵雖然能達到很高的密度,但是發酵周期一般較長.
(1)載體的發展
由於巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加體質粒,所以一般用整合型質粒作為外源基因的表達載體.整合為點一般位於組氨醇脫氫酶編碼基因HIS4區或AOX1區,典型的巴斯德畢赤酵母表達載體含有乙醇氧化酶基因5'AOX1啟動子,3'AOX1終止子,其中還有供外源基因插入的多克隆位點,以HIS4基因作為互補選擇標記或抗Zeocin作為抗性選擇標記.
(2)受體菌常用畢赤酵母宿主菌主要有GS115和KM71,均為HIS4突變型
(3)轉化方式巴斯德畢赤酵母的轉化方法有原生質體法,電激法,氯化鋰法和PEG法等.
(4)整合方式黨政和載體轉化受體菌時,它有3種整合方式.一是5'AOX1和3'AOX1能與染色體發生同源重組,使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因;二是染色體AOX1區與載體質粒的AOX1區發生單位點互換;三是染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發生置換.
(5)獲得高拷貝數整合轉化子的方法
(6)表達菌株的培養條件
(7)提高外源基因在甲醇酵母中表達的注意事項1,外源基因中A,T含量,許多高A+T含量的基因常會由於提前終止而不能有效轉錄2,密碼子是否符合甲醇酵母的偏好性,在所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的,對這些偏好密碼子的使用程度和基因表達水平成正比3,mRNA5'非凡疫區的核苷酸序列和長度會影響到核糖體40S亞單位對mRNA的識別;4,選取合適的宿主菌5,產物自身的穩定性6,甲醇酵母液體深層發酵時的培養條件是否合適.
釀酒麥牙汁
2、不是一種食品微生物,發酵時又要添加甲醇,所以,要用它來生產藥品或食品還沒有被廣泛接受.
3、發酵雖然能達到很高的密度,但是發酵周期一般較長.
(1)載體的發展
由於巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加體質粒,所以一般用整合型質粒作為外源基因的表達載體.整合為點一般位於組氨醇脫氫酶編碼基因HIS4區或AOX1區,典型的巴斯德畢赤酵母表達載體含有乙醇氧化酶基因5'AOX1啟動子,3'AOX1終止子,其中還有供外源基因插入的多克隆位點,以HIS4基因作為互補選擇標記或抗Zeocin作為抗性選擇標記.
(2)受體菌常用畢赤酵母宿主菌主要有GS115和KM71,均為HIS4突變型
(3)轉化方式巴斯德畢赤酵母的轉化方法有原生質體法,電激法,氯化鋰法和PEG法等.
(4)整合方式黨政和載體轉化受體菌時,它有3種整合方式.一是5'AOX1和3'AOX1能與染色體發生同源重組,使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因;二是染色體AOX1區與載體質粒的AOX1區發生單位點互換;三是染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發生置換.
(5)獲得高拷貝數整合轉化子的方法
(6)表達菌株的培養條件
(7)提高外源基因在甲醇酵母中表達的注意事項1,外源基因中A,T含量,許多高A+T含量的基因常會由於提前終止而不能有效轉錄2,密碼子是否符合甲醇酵母的偏好性,在所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的,對這些偏好密碼子的使用程度和基因表達水平成正比3,mRNA5'非凡疫區的核苷酸序列和長度會影響到核糖體40S亞單位對mRNA的識別;4,選取合適的宿主菌5,產物自身的穩定性6,甲醇酵母液體深層發酵時的培養條件是否合適.
釀酒麥牙汁