《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》是廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司、呼吸疾病國家重點實驗室於2010年10月9日申請的發明專利，該專利的公布號為CN103118686A，專利公布日為2013年5月22日，發明人是楊子峰、李楚源、王玉濤、招穗珊、鐘南山、林青、王政、秦笙、關文達、莫自耀、王德勤。
《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓，所述的流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒，如人流感病毒H1N1、H3N2，禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2及INF B。板藍根多糖抗病毒作用的機理在於抑制流感病毒吸附到宿主細胞上。
2017年12月11日，《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途
- 公布號：CN103118686A
- 公布日：2013年5月22日
- 申請號 ：2010800684307
- 申請日：2010年10月9日
- 申請人：廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司、呼吸疾病國家重點實驗室
- 地址：廣東省廣州市沙太北路389號
- 發明人：楊子峰、李楚源、王玉濤、招穗珊、鐘南山、林青、王政、秦笙、關文達、莫自耀、王德勤
- Int. Cl.：A61K31/715(2006.01)I、A61K36/315(2006.01)I、C08B37/00(2006.01)I、A61K9/12(2006.01)I等
- 專利代理機構：北京泛華偉業智慧財產權代理有限公司
- 代理人：劉丹妮
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
板藍根（Radix Isatidis），異名，靛青根（《本草便讀》），藍靛根（《分類草藥性》），靛根（《中藥形性經驗鑑別法》），為十字花科植物菘籃和草大青的根；或爵床科植物馬藍的根莖及根；或草大青的乾燥根。藥性苦，寒，歸心、胃經。具有清熱解毒，涼血，利咽之功效。眾多傳統中藥中，板藍根臨床治療流感歷史最為悠久。
截至2010年10月，板藍根已知成分（包括指示性成分），如吲哚類化合物、靛玉紅等都不是真正的抗病毒效應成分。該中藥品種的抗病毒作用及效應物質始終未得到清晰、科學的認定。一般生藥中板藍根多糖含量高達24.87％，有報導具有免疫調節、抗腫瘤等作用，而在各種板藍根製劑生產過程中，多糖組分卻一直被作為雜質去除。天然板藍根多糖的組分含有葡聚糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、乳糖等等。大量報導顯示多糖作為一種天然低毒性的藥物，具有免疫調節增強、抗腫瘤及抗病毒等廣泛的生物活性，尤其是隨著對其抗病毒作用的認識深入，天然多糖已成為病毒吸附阻斷劑的熱點研究對象。有報導顯示陰離子多糖往往具有抑制動物病毒的作用，如肝素、葡聚糖硫酸酯、戊聚糖多硫酸酯鈉、天然夏枯草多糖等。從天然多糖中尋找抑制病毒的有效成分，尤其是阻斷病毒吸附的有效成分是完全可能的，且具有長遠的研究及開發價值。流感病毒宿主細胞表面的唾液酸受體是以唾液酸為末端的寡糖，其成分為半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺。由於板藍根多糖的單糖種類與唾液酸受體的組分相似，因此板藍根多糖組分有可能模擬唾液酸受體的構象，與病毒的RBS相互作用，從而抑制病毒對唾液酸受體的識別、結合。已公開的有關開發利用板藍根的方法中，尚未見利用製備多糖用於抑制多種流感病毒亞型，尤其是抑制流感病毒吸附而阻斷感染的報導。
截至2010年10月，可用於治療和預防流感病毒的抗病毒藥物主要有神經氨酸酶抑制劑（NAI）奧司他韋和扎那米韋；以及M2離子通道抑制劑金剛烷胺類，包括金剛烷胺和金剛乙胺。但以上兩類化合藥物有著各種副作用以及局限性，如易產生耐藥性等，這也成為臨床治療及新藥開發的重要問題。而抗病毒中藥具有療效穩定、毒副作用較小以及不易產生耐藥性、不促使病毒變異等優點，而且藥源豐富，價格低廉，因此抗病毒中藥以其獨特的療效優勢，在治療病毒性疾病中發揮著不可替代的作用，特別是當人類面臨病毒性疾病長期而嚴峻的挑戰時，抗病毒中藥將擁有巨大的市場和廣闊的開發前景。而板藍根就是具有抗病毒作用的中藥之一。
綜上所述，存在對板藍根多糖、尤其是板藍根製劑生產過程中廢棄不用的多糖組分是否抑制病毒及其抑制機理進行研究和套用的需要，從而也存在對含板藍根多糖作為抗病毒活性成分的藥物組合物進行研究和套用的需要。
發明內容
專利目的
《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》的目的是提供板藍根多糖在治療流感病毒引起的疾病及其併發症的新醫藥用途。該發明的另一個目的是提供板藍根多糖在製備用於預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其併發症的藥物中的用途。該發明的又一目的是提供包含板藍根多糖的用於抗流感病毒的組合物及其用途。該發明的再一目的是提供治療流感病毒引起的疾病及與其並發的疾病、障礙或者病症的方法。
技術方案
《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》的技術方案是：
一方面，該發明提供板藍根多糖在預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其併發症中的用途，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓。其中，所述板藍根多糖從板藍根中提取，優選由包括以下步驟的方法製備：
A.將板藍根原料加入適當倍數的蒸餾水進行煎煮，將煎煮液濃縮後使之在50℃為18-20波美度。
B.將A步驟獲得的濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％或60％以上，靜置12小時以上，使其沉澱。
C.將醇溶液通過大孔樹脂柱，純水洗脫，收集洗脫液。
D.採用該領域已知方法使洗脫液脫去蛋白，將去除蛋白的溶液置於具有適當分子量的透析袋中透析。
E.取透析袋裡和/或外的溶液，使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得所述板藍根粗多糖粉末組分。
優選地，所述流感病毒包括但不限於甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；更優選地，所述流感病毒包括但不限於人流感病毒H1N1亞型（包括新甲型H1N1流感病毒）、H3N2亞型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型以及INFB型；另一方面，該發明提供上述板藍根多糖在製備用於預防和治療流感病毒引起的疾病及其併發症的藥物中的用途，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓。
優選地，所述流感病毒包括但不限於甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；更優選地，所述流感病毒包括但不限於人流感病毒H1N1亞型（包括新甲型H1N1流感病毒）、H3N2亞型，禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型，以及INFB型；優選地，所述藥物的劑型包括但不限於口服製劑、腸胃外給藥製劑、局部和吸入式給藥製劑和透皮製劑；更優選地，所述藥物的劑型包括但不限於氣霧劑、膠囊劑、滴耳劑、滴眼劑、眼膏劑、凝膠劑、顆粒劑、注射劑、搽劑、洗劑、滴鼻劑、軟膏劑、口服製劑、貼劑、膜劑、散劑、溶液劑、栓劑、糖漿劑、片劑和酊劑等；該發明還提供板藍根多糖在製備用於預防流感病毒引起的疾病及其併發症的保健食品或營養製劑中的用途，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓；所述流感病毒包括但不限於甲、乙型流感病毒；更優選地，所述流感病毒包括但不限於人流感病毒H1N1亞型（包括新甲型H1N1流感病毒）、H3N2亞型，禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型，以及INFB型。
再一方面，該發明提供一種用於預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其併發症的藥物組合物，其中該藥物組合物包含板藍根多糖，並且其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓；優選地，所述流感病毒包括但不限於甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；更優選地，所述流感病毒包括但不限於人流感病毒H1N1亞型（包括新甲型H1N1流感病毒）、H3N2亞型，禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型，以及INFB型；優選地，所述藥物組合物除包含板藍根多糖作為活性成分外，還包含一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑；優選地，所述藥物組合物包括但不限於口服製劑、腸胃外給藥製劑、局部和吸入式給藥製劑和透皮製劑；更優選地，所述藥物組合物的劑型包括但不限於氣霧劑、膠囊劑、滴耳劑、滴眼劑、眼膏劑、凝膠劑、顆粒劑、注射劑、搽劑、洗劑、滴鼻劑、軟膏劑、口服製劑、貼劑、膜劑、散劑、溶液劑、栓劑、糖漿劑、片劑和酊劑等；優選地，所述藥物組合物中的載體或賦形劑包括但不限於稀釋劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、基質、芳香劑、甜味劑、著色劑、防腐劑、抗氧化劑、包衣劑、成膜材料、溶劑、增溶劑、潤濕劑、吸附劑、助濾劑、乳化劑、表面活性劑、助懸劑、增稠劑、增塑劑、螯合劑、透皮促進劑、氣霧拋射劑、起泡劑、酸鹼調節劑、緩衝劑等。
該發明提供板藍根多糖的製備方法如下：
A.將板藍根原料加入適當倍數的蒸餾水進行煎煮，將煎煮液濃縮後使之在50℃為18-20波美度。
B.將A步驟獲得的濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％或60％以上，靜置12小時以上，使其沉澱。
C.將醇溶液通過大孔樹脂柱，純水洗脫，收集洗脫液。
D.採用該領域已知方法使洗脫液脫去蛋白，將去除蛋白的溶液置於具有適當分子量的透析袋中透析。
E.取透析袋裡和/或外的溶液，使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得具有適當分子量的板藍根粗多糖粉末組分。
該發明提供板藍根多糖的製備方法包括如下步驟：
A.將板藍根原料加入八倍量蒸餾水進行煎煮，第一次煎煮兩小時，得板藍根煎煮液A與藥渣。將煎煮液A過濾並倒入另一容器。往藥渣加入八倍水繼續煎煮4小時，得板藍根煎煮液B。
B.將煎煮液B過濾並與煎煮液A濾液合併，濃縮至板藍根濃縮液，波美比重計於50℃溫度下測得18-20波美度。待冷卻。
C.待板藍根濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％，靜置12小時以上，使其沉澱。
D.將醇溶液通過大孔樹脂柱，用純水洗脫，收集洗脫液。
E.取板藍根粗多糖純水溶液使用sevag法進行脫蛋白：根據蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性的特點，利用sevag試劑（氯仿∶正丁醇5:1）:板藍根粗多糖＝5:1的比例，劇烈振搖20到30分鐘，使得蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠物，從而使蛋白質分離出來，然後離心（4000轉/分鐘/分鐘×10分鐘），除去水層和溶劑層交界處變性蛋白，重複操作5次，至中層無明顯變性蛋白析出。
F.取水層，放置於不同分子量的透析袋中。裝有板藍根粗多糖的透析袋放置於燒杯中，加入三蒸水，用磁力攪拌儀攪拌24x小時。
G.取透析袋裡和/或外的溶液使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得具有適當分子量的板藍根粗多糖粉末組分。
該發明還提供所述藥物組合物的製備方法，其中所述方法包括採用分子量為3000-7000道而頓的板藍根多糖作為活性成分，按照藥用劑型添加輔料，以製劑學常規技術製成製劑。
再一方面，該發明進一步提供治療流感病毒引起的疾病及其併發症的方法，其特徵在於向受試者給予治療有效量的前述藥物組合物或給予治療有效量的板藍根多糖，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓。
為了更加清楚地說明和闡述該發明的技術方案，以下將對該發明作進一步的描述：該申請人通過對板藍根多糖的抗流感病毒作用進行了系統的研究，發現了該多糖具有良好的抗流感病毒作用，主要針對甲乙型流感病毒，其中甲型流感病毒亞型包括了人流感病毒H1N1亞型（包括新甲型H1N1流感病毒）、H3N2亞型，禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型；而對呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等其他呼吸道病毒則無抗病毒作用。抗病毒機制為通過作用於流感病毒複製周期的早期吸附階段，從而阻斷病毒感染過程。因此該發明提供了板藍根多糖具有抗流感病毒作用的藥物用途。該發明的板藍根多糖在醫藥工業上可用作抗病毒製劑及預防劑的原料。
可以採用該領域所公知的方法來製備該發明的組合物或抗病毒製劑及預防劑，優選為製劑形式。這類方法包括將活性成分與構成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。這類輔助組分包括那些該領域中常用的組分，諸如填充劑、粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、調味劑和濕潤劑。
根據該發明的藥物和藥物組分，可以使用藥物製劑技術中已知的手段、設備、方法和工序等進行製備該發明的製劑。例如，對固體製劑如片劑而言，可以將藥物的活性成分，也就是板藍根多糖與藥物載體混合均勻後一起壓片，舉例來說，常規的藥片成分，例如玉米面粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或藥物學上可接受的膠質，以形成一種含有均勻分布的板藍根多糖的固體組分。均勻分布在這裡可理解成活性成分板藍根多糖在整個組分中均一分布，從而可以很容易地被分成具有同樣活性的單位劑型。該發明的藥物或藥物組分也可以被包衣或混合在另一組分中以提供一種緩釋劑型，其中合適的包衣組分包括但不限於聚合酸以及聚合酸與例如蟲膠，鯨蠟醇和/或醋酸纖維素等材料的混合物。
還可以將該發明的藥物組合物製成臨床可接受的其它劑型，例如顆粒劑，膠囊，滴丸劑，皮下給藥製劑等。這些劑型都可以按照該領域的技術人員所熟知方法進行製備。例如製備顆粒劑時，所需要的藥物輔料包括但不限於糊精、澱粉、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纖維素鈉以及可以用來增加藥物穩定性的表面活性劑；製備膠囊劑時，可以採用該領域常見的包封材料；製備滴丸劑時，需要水溶性的輔料，例如聚乙二醇類中的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇300及皂類輔料；在製備皮下給藥製劑如注射劑時，可以根據需要選擇適當的pH調節劑和防腐劑作為輔料。
改善效果
《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》具有如下的明顯優點：
首先，在2010年10月前的各種板藍根製劑生產過程中，多糖組分一直作為雜質去除，並沒有被加以利用。該發明經過研究證明，從板藍根中提取的板藍根多糖，特別是分子量在3000-7000道而頓的板藍根多糖具有抗流感病毒的作用，可以用於製備醫藥製劑或起預防作用的保健品，拓寬了板藍根中國這一傳統中藥的開發和套用範圍；其次，在已公開的板藍根的開發利用中，尚未見利用從板藍根製備的活性多糖用於抑制多種流感病毒亞型，尤其是抑制流感病毒吸附的報導。該發明從板藍根中提取活性多糖後，明確了其有效抗病毒成分及其抗病毒的作用機制，對臨床套用板藍根具有很大的參考價值；再次，在已有的流感治療和預防方法和製劑中，存在活性物質提取分離的技術缺陷，而該發明利用中國傳統中藥板藍根，從中提取活性多糖作為抗流感病毒的活性成分，在臨床套用和保健中具有更安全、穩定的優勢。
附圖說明
圖1為板藍根多糖的分離技術路線及活性篩選；
圖2為板藍根多糖組分G2（3500-7000道而頓）對不同流感病毒的血凝抑制作用。
技術領域
《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》屬於醫藥技術領域，具體地，該發明涉及用於治療流感病毒引起的疾病的藥物組合物及其製備方法。該發明還涉及所述藥物組合物在製備抗流感病毒的藥物、預防製劑、保健食品以及營養製劑的用途。該發明還涉及治療流感病毒引起的疾病及與其並發的疾病、障礙或者病症的方法。
權利要求
1.板藍根多糖在製備用於預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其併發症的藥物中的用途，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓。
2.如權利要求1所述的用途，其中，所述板藍根多糖從板藍根中提取。
3.如權利要求2所述的用途，其中，所述板藍根多糖由包括以下步驟的方法製備：
A.將板藍根原料加入適當倍數的蒸餾水進行煎煮，將煎煮液濃縮後使之在50℃為18-20波美度；
B.將A步驟獲得的濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％或60％以上，靜置12小時以上，使其沉澱；
C.將醇溶液通過大孔樹脂柱，純水洗脫，收集洗脫液；
D.使洗脫液脫去蛋白，將去除蛋白的溶液置於具有適當分子量的透析袋中透析；
E.取透析袋裡和/或外的溶液，使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得所述板藍根粗多糖粉末組分。
4.如權利要求1所述的用途，其中，所述流感病毒包括甲、乙型流感病毒和禽流感病毒。
5.如權利要求4所述的用途，其中，所述流感病毒包括人流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型以及INFB型。
6.如權利要求5所述的用途，其中，所述人流感病毒H1N1亞型包括新甲型H1N1流感病毒。
7.如權利要求1-6中任一項所述的用途，其中，所述藥物的劑型包括口服製劑、腸胃外給藥製劑、局部和吸入式給藥製劑和透皮製劑。
9.如權利要求8所述的用途，其中，所述溶液劑包括糖漿劑。
10.板藍根多糖在製備用於預防流感病毒引起的疾病及其併發症的保健食品或營養製劑中的用途，其中，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓。
11.根據權利要求10所述的用途，其中，所述流感病毒包括甲、乙型流感病毒。
12.根據權利要求11所述的用途，其中，所述流感病毒包括人流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型以及INFB型。
13.如權利要求12所述的用途，其中，所述人流感病毒H1N1亞型包括新甲型H1N1流感病毒。
14.一種用於預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其併發症的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含分子量為3000-7000道而頓的板藍根多糖。
15.如權利要求14所述的藥物組合物，其中，所述流感病毒包括甲、乙型流感病毒和禽流感病毒。
16.如權利要求15所述的藥物組合物，其中，所述流感病毒包括人流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型，可感染人的禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型，以及INFB型。
17.如權利要求16所述的藥物組合物，其中，所述人流感病毒H1N1亞型包括新甲型H1N1流感病毒。
18.如權利要求14-17中任一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物除包含板藍根多糖作為活性成分外，還包含一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。
19.如權利要求18所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括口服製劑、腸胃外給藥製劑、局部和吸入式給藥製劑和透皮製劑。
20.如權利要求19所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物的劑型包括氣霧劑、膠囊劑、滴耳劑、滴眼劑、眼膏劑、凝膠劑、顆粒劑、注射劑、搽劑、洗劑、滴鼻劑、軟膏劑、貼劑、膜劑、散劑、溶液劑、栓劑、片劑和酊劑。
21.如權利要求20所述的藥物組合物，其中，所述溶液劑包括糖漿劑。
22.如權利要求18所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物中的載體或賦形劑包括稀釋劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、基質、芳香劑、甜味劑、著色劑、防腐劑、抗氧化劑、包衣劑、成膜材料、溶劑、增溶劑、潤濕劑、吸附劑、助濾劑、乳化劑、表面活性劑、助懸劑、增稠劑、增塑劑、螯合劑、透皮促進劑、氣霧拋射劑、起泡劑、酸鹼調節劑和緩衝劑。
23.板藍根多糖的製備方法，所述板藍根多糖的分子量為3000-7000道而頓，所述方法包括如下步驟：
A.將板藍根原料加入適當倍數的蒸餾水進行煎煮，將煎煮液濃縮後使之為18-20波美度；
B.將A步驟獲得的濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％或60％以上，靜置12小時以上，使其沉澱；
C.將醇溶液通過大孔樹脂柱，純水洗脫，收集洗脫液；
D.採用該領域已知方法使洗脫液脫去蛋白，將去除蛋白的溶液置於具有適當分子量的透析袋中透析；
E.取透析袋裡和/或外的溶液，使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得具有適當分子量的板藍根粗多糖粉末組分。
24.如權利要求23所述的板藍根多糖的製備方法，其中，所述方法包括如下步驟：
A.將板藍根原料加入八倍量蒸餾水進行煎煮，第一次煎煮兩小時，得板藍根煎煮液A與藥渣；將煎煮液A過濾並倒入另一容器，往藥渣加入八倍水繼續煎煮4小時，得板藍根煎煮液B；
B.將煎煮液B過濾並與煎煮液A濾液合併，濃縮至板藍根濃縮液，波美比重計於50℃溫度下測得18-20波美度，待冷卻；
C.待板藍根濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇使得濃縮液含醇量達60％，靜置12小時以上，使其沉澱；
D.將醇溶液通過大孔樹脂柱，用純水洗脫，收集洗脫液；
E.取板藍根粗多糖純水溶液使用sevag法進行脫蛋白：根據蛋白質在有機溶劑中變性的特點，利用sevag試劑：板藍根粗多糖＝5:1的比例，劇烈振搖20到30分鐘，使得蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠物，從而使蛋白質分離出來，然後離心，除去水層和溶劑層交界處變性蛋白，重複操作5次，至中層無明顯變性蛋白析出；
F.取水層，放置於不同分子量的透析袋中，裝有板藍根粗多糖的透析袋放置於燒杯中，加入三蒸水，用磁力攪拌儀攪拌24小時；
G.取透析袋裡和/或外的溶液使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將獲得的組分凍乾至粉末狀，獲得具有適當分子量的板藍根粗多糖粉末組分。25.如權利要求24所述的板藍根多糖的製備方法，其中，所述有機溶劑為氯仿。
26.如權利要求24所述的板藍根多糖的製備方法，其中，所述sevag試劑為氯仿：正丁醇5:1。
27.如權利要求24所述的板藍根多糖的製備方法，其中，所述離心為在4000轉/分鐘下離心10分鐘。
28.如權利要求14-17中任一項所述的藥物組合物的製備方法，其中，所述方法包括採用分子量為3000-7000道而頓的板藍根多糖作為活性成分，按照藥用劑型添加輔料，以製劑學常規技術製成製劑。
實施方式
- 實施例1 板藍根多糖粉末的製備
按如下方法製備進行體外抗病毒活性測定的板藍根多糖粉末：
1、板藍根水提物的製備
（1）取板藍根GAP藥材10千克用8倍水量煎煮2次，第1次2小時，第2次4小時，得板藍根煎煮液。
（2）將板藍根煎煮液過濾，濾液合併，濃縮至18～20波美度（50攝氏度測），得板藍根濃縮液。
（3）將板藍根濃縮液冷卻至45℃以下，加乙醇至含醇量達60％，靜置12小時以上使沉澱。
（4）取醇溶液，通過大孔樹脂，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、100％乙醇等不同極性溶劑洗脫，得不同極性溶劑洗脫液。
（5）將不同極性溶劑洗脫液採用細胞病變抑制法（CPE法）進行體外抗病毒活性測定，得到活性成分為水洗脫液（S-03）。
（6）按上述方法製備的水洗脫液即為板藍根粗多糖溶液。
2、板藍根多糖的分離
（1）取多糖百分含量為70％板藍根粗多糖溶液使用sevag法進行除蛋白，根據蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性的特點，利用sevag試劑（氯仿:正丁醇5:1）:板藍根粗多糖＝5:1的比例，劇烈振搖20到30分鐘，使得蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠物，從而使蛋白質分離出來，然後離心（4000轉/分鐘/分鐘×10分鐘），除去水層和溶劑層交界處變性蛋白，重複操作5次，至中層無肉眼明顯可見的變性蛋白析出。
（2）取水層，放置於不同分子量的透析袋中，透析袋的分子量分別為＜3500道而頓、3500-7000道而頓、7000-14000道而頓和＞14000道而頓。將裝有板藍根粗多糖的透析袋放置於燒杯中，加入三蒸水，用磁力攪拌儀攪拌24小時。
（3）取透析袋內、外的溶液各2mL，分別加入質量濃度為0.05克/毫升的α-萘酚溶液1.0毫升L，搖勻，再垂直快速加入5.0毫升濃H2SO4，充分振搖，靜置5分鐘後，觀察顏色變化。反應後可觀察到在α-萘酚與濃硫酸之間層出現紫色環，說明此溶液含有糖類。
（4）把透析袋內、外的粗多糖溶液，分別使用旋轉蒸發儀蒸發至濃縮液後，利用真空冷凍乾燥機將四個不同分子量的組分凍乾至粉末狀，得板藍根不同分子量的粗多糖粉末，包括粉末G1（＜3500道而頓）、G2（3500-7000道而頓）、G3（7000-14000道而頓）和G4（＞14000道而頓）。
- 實施例2 板藍根多糖不同組分的體外抗病毒活性初篩
將分離純化得到的四個不同分子量的多糖組分，進行了體外抗病毒活性初篩。
1、實驗材料同前（細胞、病毒及藥材來源）
2、實驗方法
以細胞病變抑制法（Cytopathic Effect Reduction Method）在治療、保護和病毒吸附三種試驗策略下進一步確認板藍根多糖不同組分對流感病毒的抑制作用。
（1）治療模式：在24孔細胞培養板內使用含10％滅活血清（FBS）的MEM培養基，進行MDCK細胞培養，待長成80％融合度；設定陽性藥物（病毒唑）和測定的不同濃度藥物即實施例1的不同分子量的板藍根多糖；在37℃，5％CO2環境下進行病毒吸附細胞2小時；向24孔細胞培養板內培養的MDCK細胞中分別加入陽性藥物（病毒唑）、不同濃度（起始濃度G1-4:10毫克/毫升，2倍稀釋）的測定藥物（除陰性對照外），然後在37℃，5％CO2環境下培養。
（2）保護模式：在24孔細胞培養板內，培養MDCK細胞（同治療模式所採用的細胞及其條件）；向培養的MDCK細胞中加入藥物（同治療模式所採用的陽性藥物和測定藥物及其濃度），孵育2小時；進行病毒吸附2小時（同治療模式所採用的病毒及實驗條件）；換含TPCK胰酶的無血清MEM，在37℃、5％CO2環境下培養。
（3）直接作用模式：病毒與不同濃度的藥物37℃孵育1小時後接種於細胞中，置於4℃孵育1小時，吸棄上清，換含TPCK的無血清培養基37℃培養8小時。
在不同模式下，培養24小時和48小時後在倒置顯微鏡下觀察細胞病變（CPE）。試驗時設陽性藥對照、正常細胞對照及病毒對照。當病毒對照出現“++”則終止實驗，細胞出現病變程度按以下6級標準記錄：-為細胞生長正常，無病變出現；±為細胞病變少於整個單層細胞的10％；+為細胞病變約占整個單層細胞的25％；++為細胞病變約占整個單層細胞的50％；+++為細胞病變約占整個單層細胞的75％：++++為細胞病變約占整個單層細胞的75％以上。用Reed-Muench法計算半數抑制濃度（IC50），並以選擇指數SI表示（SI＝TC50/IC50，TC50為藥物半數有毒濃度），SI＞2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI＜1表示無效。
2、體外抗流感病毒活性初篩結果
以細胞病變抑制法在治療、保護和病毒吸附三種試驗策略下，使用流感病毒A/PR/8/34株，進一步確認板藍根多糖不同組分G1、G2、G3、G4對流感病毒的抑制作用，結果只有G2具有明顯的體外抗病毒作用。
樣品名稱 | TC50 | A | B | C | |||
IC50 | sI | IC50 | SI | IC50 | SI | ||
G1 | 27.5 | >10 | <1 | 10 | <1 | >10 | <1 |
G2 | 14.5 | >10 | <1 | 2.5 | 5.8 | 0.625 | 23.2 |
G3 | 6.9 | >10 | <1 | >10 | <1 | >10 | <1 |
G4 | 10 | >10 | <1 | >10 | <1 | >10 | <1 |
選擇指數（SI），SI＞2表示低毒有效；SI＝1～2表示高毒低效；SI＜1表示無效。A：保護模式；B：治療模式；C：直接模式。
- 實施例3 板藍根多糖組分G2的毒性試驗（MTT法）
1、實驗方法
常規製備MDCK細胞，接種到96孔板，24小時後待細胞長成單層後，棄去培養液，設定毒性試驗孔、空白對照孔和正常細胞對照孔，除細胞培養液外，各孔中加入情況如下：
（1）空白孔：無細胞生長，加入100微升/孔MEM；
（2）正常細胞對照孔：正常細胞生長，加入100微升/孔MEM、相同濃度的藥物溶解介質（MEM）；
（3）毒性試驗孔：正常細胞生長，不同稀釋度（2倍稀釋）的板藍根多糖組分G2100微升/孔，37℃，5％CO2繼續培養36-48小時之後，每孔加20微升MTT溶液（5毫克/毫升），置37℃，5％CO2溫箱中繼續孵育4小時。吸棄培養上清液，每孔加100微升二甲基亞碸（DMSO），低速振盪10分鐘，使結晶物充分融解。選擇570納米波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值。按照下列公式計算抑制率：抑制率＝[（正常-空白）-（給藥-空白）]/（正常-空白）×100％；並用Reed-Muench法計算50％毒性濃度為藥物半數有毒濃度（TC50）。
2、藥物毒性試驗結果
藥物樣品對病毒宿主細胞的毒性試驗是抗病毒藥效評價的前提，利用MTT法測得受試樣品G2的藥物半數有毒濃度（TC50）為14.5毫克/毫升。
- 實施例4 板藍根多糖組分G2的抗流感病毒藥效確認
1、實驗方法
以空斑減少實驗（Plaque Reduction Assay）在治療、保護和病毒吸附三種試驗策略下進一步確認板藍根多糖組分G2對流感病毒的抑制作用。經過不同模式處理（同上）的細胞單層細胞上加入1.5毫升瓊脂糖營養物，內含0.2％BSA，0.8％Agar和0.3％DEAE-Dextran，置34℃、5％CO2條件下培養3天，以福馬林緩衝結晶紫溶液（0.1％）固定和染色並計算空班形成單位（PFU/毫升）。用Reed-Muench法計算半數抑制濃度（IC50），並以選擇指數SI表示，SI＝TC50/IC50。
2、抗流感病毒藥效結果
以空斑減少實驗在治療、保護和病毒吸附三種試驗策略下進一步確認板藍根多糖組分G2對流感病毒的抑制作用。結果見表1。
病毒亞型 | 毒株 | IC50 | 治療指數（SI） |
H1N1 | （PR8） | 0.39 | 37 |
H1N1 | （FM1） | 2.52 | 5.75 |
H1N1 | （S-OIV） | 4.3 | 3.4 |
H1N1 | （Isolate） | 1.25 | 11.6 |
H3N2 | （ Aichi ） | 2.85 | |
H6N2 | （GD） | 5 | 2.9 |
H7N3 | （GD） | 3.96 | 3.6 |
H9N2 | （GD） | 3.91 | 3.7 |
INFB | （Isolate） | 3.63 | 4 |
A：保護模式；B：治療模式；C：直接模式。SI＞2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI：1表示無效。
- 實施例5 板藍根多糖組分G2的流感病毒血凝抑制實驗
1、實驗方法
取一定量抗凝雞血後，用生理鹽水洗滌3次，用無菌生理鹽水配成0.5％雞紅細胞懸液。於96孔板中加入系列稀釋（2倍）的G2樣品100微升，於每孔中加入50微升4個血凝單位（HAU）的流感病毒懸液，置4℃45分鐘後，加入50微升/孔的0.5％雞紅細胞懸液，搖勻置4℃冰櫃30-60分鐘後觀察結果。
2、流感病毒血凝抑制實驗結果
實驗結果見圖2。
G2在血凝抑制試驗中對不同亞型流感病毒株的血凝素有不同程度的抑制作用。而對同樣有血凝素的副流感病毒卻無抑制作用，顯示了其對流感病毒的特異性作用。
- 實施例6 板藍根多糖組分G2對其他呼吸道病毒（非流感病毒）抑制作用1、材料和實驗方法
（1）細胞：
狗腎細胞（MDCK）、人喉癌細胞（HEp-2）、猴腎細胞（LLC-MK2）分別引自美國經典培養物收藏中心（ATCC）及中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。
（2）病毒株：
腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒3型（PIV-3）購自ATCC。
（3）實驗方法：每株病毒以100TCID50的病毒量感染相應宿主細胞，加入倍比（2倍）稀釋的板藍根多糖組分G2100微升，置5％CO2，37℃48小時後觀察結果，細胞出現病變的程度同實施例1，用Reed-Muench法計算半數抑制濃度（IC50）。
2、對其他呼吸道病毒（非流感病毒）抑制作用結果
結果見表2。
病毒類型 | 宿主細胞 | 板藍根多糖組分G2 | ||
DNA病毒 | 腺病毒 （ADV） | HEp-2 | IC50 | >10 |
SI | <1 | |||
RNA病毒 | 呼吸道合胞病毒 （RSV） | HEp-2 | IC50 | >10 |
SI | <1 | |||
副流感病毒3 （PIV-3） | LLC-MK2 | IC50 | >10 | |
SI | <1 | |||
實驗結果表明板藍根多糖組分G2抗病毒作用表現為直接作用模式，對多種亞型的流感病毒具有明顯的體外抑制作用，且對不同亞型流感病毒的血凝素均有不同程度抑制作用，從而抑制病毒吸附宿主細胞，顯示出了良好的體外抗病毒作用。由於對其他呼吸道病毒（非流感病毒）無抑制作用，顯示出了對抑制流感病毒的特異性。
榮譽表彰
2017年12月11日，《板藍根多糖在製備抗流感病毒的藥物中的用途》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
