提取純化DNA的試劑

《提取純化DNA的試劑》是公安部物證鑑定中心於2009年8月5日申請的專利，該專利的申請號為2009100903356，公布號為CN101613696，授權公布日為2009年12月30日，發明人是趙興春、葉健、姜伯瑋。

《提取純化DNA的試劑》公開了一種提取純化DNA的試劑。該試劑由以下物質組成：預處理裂解液：pH為7.4－8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10－100毫摩爾/升緩衝鹽，0.5％－5％表面活性劑，1－100毫摩爾/升螯合劑和50－150毫摩爾/升可溶性鹽，0.2－4毫克/毫升蛋白酶K；裂解結合液：pH＝6.4－7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20－150毫摩爾/升緩衝鹽，3－8MChaotropic鹽，1－10％表面活性劑，0.5－4％兼性離子去污劑，10－100毫摩爾/升螯合劑以及15－30％醇；洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4－6MChaotropic鹽，25－50％醇和10－100毫摩爾/升螯合劑；洗滌液II為75％乙醇水溶液；洗脫液為TE（10毫摩爾/升 Tris－HCl，1毫摩爾/升EDTA，pH為8.0）；磁珠懸浮液為納米級矽包被磁性微球（50－100毫克/毫升）。採用該試劑提取DNA效率高達93.67％。

2016年12月7日，《提取純化DNA的試劑》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：提取純化DNA的試劑
• 公布號：CN101613696
• 授權日：2009年12月30日
• 申請號：2009100903356
• 申請日：2009年8月5日
• 申請人：公安部物證鑑定中心
• 地址：北京市西城區木樨地南里17號
• 發明人：趙興春、葉健、姜伯瑋
• Int.Cl.：C12N15/10(2006.01)I、C07H21/04(2006.01)I
• 代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
• 代理人：關暢、任鳳華

專利背景

DNA分離純化是分子生物學實驗中重要的操作，核酸的質量直接關係到後續操作能否順利進行。生物學、法醫學和基因組學的發展，強化了對從各種生物檢材中獲得核酸的複雜方法的需求。例如，脫氧核糖核酸提供了廣泛的關於遺傳起源和遺傳多態性信息。這些信息可用於法醫遺傳學鑑定實踐。

2009年8月前所存在的各種核酸純化方法皆可分成以下兩大類：液相純化和固相純化。在液相純化中，核酸維持為液體狀態，而雜質通過沉澱、離心被除去或者核酸被沉澱出來，而雜質被保留；在固相純化中，核酸被結合到固相載體上，而雜質被選擇性洗脫。例如，採用液相純化來分離的DNA保留在液相中，而雜質被通過諸如沉澱和/或離心之類的方法除去。在固相純化中DNA結合到固相載體上，而雜質如RNA、蛋白質和磷脂等被選擇性洗脫。在DNA純化中，如果起始材料包括細胞，液相方法和固相方法都需要細胞或病毒共破裂，或裂解步驟。破裂或裂解步驟產生與污染物如RNA、脂質、碳水化合物、蛋白質等混合的DNA。這種混合物還含有降解DNA的必須被除去和/或滅活以不感染產生基本上未降解的DNA的DNA酶。兩個純化大類以前都利用常規的方法，需要繁瑣的步驟，且通常用到有害的試劑，現在也出現了更快速的提取方法，如Chelex-100法，僅需要較少的步驟，且通常較少的有害試劑。

Chelex-100法一種快速液相DNA純化方法，Chelex-100是一種化學整合樹脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，整合多價金屬離子，尤其是選擇性整合二價離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結合力.能結合許多可能影響一步分析的其他外源物質。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結合的物質與DNA分離，防止結合到Chelex中的抑制劑或雜質帶到PCR反應中，影響下一步的DNA分析，並通過結合金屬離子，防止DNA降解。利用螯合劑去除生物樣品中金屬雜質而達到純化的目的。該法首先用去離子水洗滌生物樣品，加入螯合樹脂的懸浮液56℃孵育一定時間，100℃孵育 8分鐘，然後通過離心去除雜質。該方法簡單、快速（僅涉及到兩種試劑的使用）。但該法提取得到的DNA純度不夠，不能滿足微量DNA生物樣品DNA提取純化的要求。

固相提取方法近年來發展迅速，在核酸提取領域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個主要步驟：裂解細胞使細胞膜、核膜DNA破裂以釋放DNA；釋放的DNA與固相載體結合；雜質的洗滌；洗脫而得到純化的DNA。對於固相DNA純化，已使用了多種固相載體，如二氧化矽微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉澱、硅藻土、玻璃粉等。當核酸存在於在高濃度離液鹽以及低的pH溶液中時，能夠吸附到矽類介質表面，並在低鹽高pH溶液中洗脫下來，從而達到提取純化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉從瓊脂糖凝膠中提取到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提純質粒DNA。Boom等對該方法加以改進，用二氧化矽和硅藻土為固相吸附劑，用來提取純化人血清或尿液中的微量病原體基因組DNA。該方法需要六步離心、五種試劑從全血中純化DNA。

發明內容

技術方案

《提取純化DNA的試劑》提供試劑是由以下物質組成：

預處理裂解液：pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10-100毫摩爾/升緩衝鹽，0.5-5克/100毫升的表面活性劑，1-100毫摩爾/升的螯合劑，50-150毫摩爾/升的可溶性鹽和0.2-4毫克/毫升的蛋白酶K；

裂解結合液：pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20-150毫摩爾/升的緩衝鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％（體積百分含量）的表面活性劑，0.5-4克/100毫升的兼性離子去污劑，10-100毫摩爾/升的螯合劑以及15-30％（體積百分含量）的醇；

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4-6M的Chaotropic鹽，25-50％（體積百分含量）的醇和10-100毫摩爾/升的螯合劑；

洗滌液II：75-80％（體積百分含量）乙醇水溶液；

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是0-20毫摩爾/升的Tris-HCl，0-2毫摩爾/升的EDTA；

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液的成分如下：直徑為50-1200納米的納米級矽包被磁性微球50-100毫克，其餘為水。

精斑和毛髮中DNA的提取，需在預處理裂解液中加入DTT（二硫蘇糖醇），上述 預處理裂解液中，溶質還包括0.025-0.05M的二硫蘇糖醇。所以《提取純化DNA的試劑》提供的另一種提取純化DNA的試劑，是由以下物質組成：

預處理裂解液：pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10-100毫摩爾/升緩衝鹽，0.5-5克/100毫升的表面活性劑，1-100毫摩爾/升的螯合劑，50-150毫摩爾/升的可溶性鹽和0.2-4毫克/毫升的蛋白酶K和0.025-0.05M的二硫蘇糖醇；

裂解結合液：pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20-150毫摩爾/升的緩衝鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％（體積百分比）的表面活性劑，0.5-4克/100毫升的兼性離子去污劑，10-100毫摩爾/升的螯合劑以及15-30％（體積百分含量）的醇；

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4-6M的Chaotropic鹽，25-50％（體積百分含量）的醇和10-100毫摩爾/升的螯合劑；

洗滌液II：75-80％（體積百分含量）乙醇水溶液；

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是0-20毫摩爾/升的Tris-HCl，0-2毫摩爾/升的EDTA；

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液的成分如下：直徑為50-1200納米的納米級矽包被磁性微球50-100毫克，其餘為水。

上述二硫蘇糖醇的濃度優選是0.04M-0.05M。

上述所有的預處理裂解液中，緩衝鹽的濃度優選為20-80毫摩爾/升，表面活性劑的濃度優選為0.5-4克/100毫升，螯合劑的濃度優選為20-80毫摩爾/升，可溶性鹽的濃度優選為50-130毫摩爾/升，蛋白酶K的濃度優選為0.2-2毫克/毫升；所述可溶性鹽更優選為80-100毫摩爾/升，蛋白酶K更優選為0.2-1毫克/毫升；所述預處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉；所述消化液還包括一種可溶性鹽溶液，DNA從細胞核中釋放並與組蛋白分離後，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定濃度氯化鈉溶液中的溶解度很高，Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這使DNA在溶液中呈溶解狀態並維持DNA在溶液中的穩定性。在某些實施例中，可以使用NaCl等可溶性鹽。

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族胺基酸和芳香族胺基酸的羧基端肽鍵，用於生物樣品中蛋白質的一般降解。此酶經純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由於蛋白酶K在尿素和SDS中穩定，還具有降解天然蛋白質的能力，因而它套用很廣泛

各種生物檢材，如血斑、精斑、菸蒂、毛髮、組織等首先要經過預處理裂解液浸泡，並在50-65℃的溫度下孵育0.5h-4h後，方可進行後續提取操作。孵育的溫度優選為56-60℃。

通過預處理裂解液對生物樣本的預處理，一是能夠使載體上黏附的細胞（如血白細胞、精子細胞、上皮細胞等）和DNA與載體分離或與組織中脫離，游離在預處理裂解液中；二是裂解細胞，使DNA和蛋白質、磷脂等污染物釋放至消化液中，通過離心等方法去除載體後即形成粗裂解液並完成樣本預處理。

預處理後形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白質、細胞碎片、磷脂等細胞污染物。為了更充分的裂解細胞，最大程度的使DNA從細胞中釋放出來，並使釋放出來的DNA與磁性微球結合以達到分離純化的目的，可以使用裂解結合液。

上述裂解結合液中，Chaotropic鹽的濃度優選為4-6M，緩衝鹽的濃度優選為50-120毫摩爾/升，螯合劑的濃度優選為20-80毫摩爾/升，表面活性劑的濃度優選為2-8％（體積百分比），兼性離子去污劑的濃度優選為1-3克/100毫升，醇的濃度優選為20-28％（體積百分含量）；所述裂解結合液中的表面活性劑優選用非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑為TritonX-100、Tween20、Tween21、Tween.40、Tween60、Tween80、Tween85、NP-40、Brij30或Span20；所述兼性離子去污劑是3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸；所述醇是乙醇、異丙醇或聚乙二醇。

上述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度優選為4.2-5.8M，醇為30-45％（體積百分含量）的乙醇，螯合劑的濃度優選為20-80毫摩爾/升。

上述洗滌液II優選為：75％乙醇水溶液。

上述洗滌液I和II用來洗滌DNA-磁性納米微球形成的複合體，以除去與磁珠結合的除核酸以外的污染物如蛋白質、磷脂。

所述洗脫液中的Tris-HCl的濃度優選10毫摩爾/升、EDTA的濃度優選1毫摩爾/升，所述洗脫液pH優選為8.0。在除去與固相載體結合的蛋白質、磷脂等污染物後，必須將與固相載體結合的DNA洗脫至水相溶液中才能套用於後續法醫DNA分析。DNA-磁性微球複合體與洗脫液接觸後，可以使DNA與固相載體分離。

洗脫液可以是低離子強度的水相溶液，也可以是無離子水或是一定pH的低離子強度的水溶液。洗脫液pH值必須能夠保證DNA穩定性、完整性。可以是低濃度TE（10毫摩爾/升 Tris-HCl，1毫摩爾/升EDTA，pH8.0）洗脫與固相載體結合的DNA。

上述每毫升磁珠懸浮液的中的納米級矽包被磁性微球優選為50毫克。

在上述試劑中，所述緩衝鹽為Tris-HCl、磷酸鹽或HEPES鹽。

上述Chaotropic鹽在水性溶液中具有高溶解度。高濃度的Chaotropic鹽能夠引起蛋白質打開摺疊、破壞核酸的二級結構並使變性的蛋白質和雙鏈DNA溶解。通常認為，這是由於Chaotropic鹽離子能夠破壞其所在溶液體系中的氫鍵網路，使變性的蛋白質和變性DNA表現出比其正確摺疊或天然構象時更高的熱動力學穩定性，而且能夠保證讓DNA優先結合到磁性納米微球上。這種Chaotropic鹽可以是任何已知的Chaotropic鹽，如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉、三氯醋酸鹽。發明中使用的是胍鹽（如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍）。尤其是異硫氰酸胍，能夠更好的裂解細胞並抑制核酸酶的活性，是一中非常有效DNA純化試劑。Chaotropic鹽可以3～8M濃度存在於裂解結合液中。在《提取純化DNA的試劑》任何一種含有Chaotropic鹽的試劑中，Chaotropic鹽的濃度必須要低於其所在該試劑中的溶解度。一定Chaotropic鹽的濃度大小能夠影響DNA與磁性納米微球結合。Chaotropic鹽必須達到一定的濃度才能促使DNA與磁性微球的結合。但是過高的鹽濃度會使蛋白質變性和DNA降解，並從溶液中沉澱出來。蛋白質和大分子的雙鏈DNA在Chaotropic鹽濃度為0.5～2M時穩定存在於溶液中。相反，RNA、小分子DNA如單鏈DNA、DNA片段，在濃度為2～5M時穩定純在於溶液體系中。

上述螯合劑是一種能夠與Na、Mg、Ca、Mn、Zn等金屬離子相結合的複合物。螯合劑中至少有兩個的非金屬離子與游離金屬陽離子形成共價鍵並與其結合，與螯合劑結合的金屬離子將不再游離於溶液體系中。當溶液體系中有螯合劑存在時，會降低溶液中金屬離子的濃度。游離金屬離子濃度的降低使核酸酶失活，能夠有效防止DNA被核酸酶降解、起到保護DNA完整性的作用。很多可供使用的螯合劑，不僅限於EDTA、EGTA、CDTA。

上述的試劑製成的試劑盒也屬於《提取純化DNA的試劑》的保護範圍之內。

《提取純化DNA的試劑》所提供的試劑及試劑盒能夠實現從各種類型生物樣本（血液、血斑、精液、精斑、毛髮、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑、脫落細胞等接觸性檢材、腐敗陳舊檢材）中提取、純化DNA。且能夠同時滿足常規及微量DNA的樣本的提取要求。利用《提取純化DNA的試劑》試劑純化所得的DNA無需進一步純化，即可套用於STR複合擴增、DNA測序、DNA定量等下游分析操作。《提取純化DNA的試劑》的試劑及其試劑盒系統提取的DNA特別適合套用於PCR擴增（STR、DNA測序、實時螢光定量PCR等）。

有益效果

整體操作簡單、快速；廣泛的生物樣品適用範圍，能夠實現大多數生物樣品的DNA提取；裂解效果好，保證細胞的充分裂解以釋放DNA；純化能力強，能夠在混合有大量PCR抑制劑或污染物的樣本中得到足夠純且可完全滿足於下游PCR、DNA測序、實時螢光定量等操作的DNA；提取效率高。能夠達到90％以上的提取效率，最大化避免DNA在提取操作過程的損失；將該發明提供的試劑和方法套用於已知濃度的DNA標準品的提取，經過整個提取過程，通過以下公式計算得到提取效率（洗脫得到的DNA量（納克）/加入DNA標準品（G1471，Promega公司）總量（納克）能夠有效提高痕量、降解等微量DNA生物樣品的STR分型成功率；靈活的試劑體系，通過擴大試劑的操作體系，可實現大體積樣本中所含微量DNA樣本的富集；整個操作能夠避免離心操作，可適用用於各種DNA自動化提取操作平台。

附圖說明

圖1為採用實施例1的試劑和方法提取DNA的效果驗證圖，其中圖1A是微量血液的DNASTR分型圖譜，圖1B是螢光定量PCR電泳圖譜。

圖2為3×3毫米血斑（FTA卡）STR分型圖譜。

圖3為棉簽上血斑（2微升抗凝血）STR分型圖譜。

圖4為2微升液態抗凝血與PCR抑制劑等混合在無色棉布上形成血斑的STR圖譜。

圖5為2微升液態抗凝血滴在牛仔褲形成血斑的STR分型圖譜。

圖6為1微升精液在無色棉布上形成精斑的STR分型圖譜。

圖7為50微升唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子的STR分型圖譜。

圖8為菸蒂STR分型圖譜。

圖9為自然脫落毛髮STR分型圖譜。

圖10為人體組織塊的DNATyper15STR分型圖譜。

圖11為手機上的脫落細胞STR分型圖譜。

圖12為毛衣上的脫落細胞STR分型圖譜。

圖13為錢包上脫落細胞STR分型圖譜。

圖14為杯口脫落細胞STR分型圖譜。

圖15為鍵盤脫落細胞STR分型圖譜。

圖16為腐敗血斑STR分型圖譜。

圖17為腐敗組織STR分型圖譜。

技術領域

《提取純化DNA的試劑》涉及生物技術領域，特別涉及一種提取純化DNA的試劑。

權利要求

1、一種提取純化DNA的試劑，由以下物質組成：

預處理裂解液：pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10-100毫摩爾/升緩衝鹽，0.5-5克/100毫升的表面活性劑，1-100毫摩爾/升的螯合劑，50-150毫摩爾/升的可溶性鹽和0.2-4毫克/毫升的蛋白酶K；

裂解結合液：pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20-150毫摩爾/升的緩衝鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％（體積百分比）的表面活性劑，0.5-4克/100毫升的兼性離子去污劑，10-100毫摩爾/升的螯合劑以及15-30％（體積百分含量）的醇；

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4-6M的Chaotropic鹽，25-50％（體積百分含量）的醇和10-100毫摩爾/升的螯合劑；

洗滌液II：75-80％（體積百分含量）乙醇水溶液；

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是0-20毫摩爾/升的Tris-HCl，0-2毫摩爾/升的EDTA；

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液的成分如下：直徑為50-1200納米的納米級矽包被磁性微球50-100毫克，其餘為水。

2、一種提取純化DNA的試劑，由以下物質組成：

預處理裂解液：pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10-100毫摩爾/升緩衝鹽，0.5-5克/100毫升的表面活性劑，1-100毫摩爾/升的螯合劑，50-150毫摩爾/升的可溶性鹽和0.2-4毫克/毫升的蛋白酶K和0.025-0.05M的二硫蘇糖醇；

裂解結合液：pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20-150毫摩爾/升的緩衝鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％（體積百分比）的表面活性劑，0.5-4克/100毫升的兼性離子去污劑，10-100毫摩爾/升的螯合劑以及15-30％（體積百分含量）的醇；

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4-6M的Chaotropic鹽，25-50％（體積百分含量）的醇和10-100毫摩爾/升的螯合劑；

洗滌液II：75-80％（體積百分含量）乙醇水溶液；

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是0-20毫摩爾/升的Tris-HCl，0-2毫摩爾/升的EDTA；

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液的成分如下：直徑為50-1200納米的納米級矽包被磁性微球50-100毫克，其餘為水。

3、根據權利要求1或2所述的試劑，其特徵在於：所述預處理裂解液中，緩衝鹽的濃度為20-80毫摩爾/升，表面活性劑的濃度為0.5-4克/100毫升，螯合劑的濃度為20-80毫摩爾/升，可溶性鹽的濃度為50-130毫摩爾/升，蛋白酶K的濃度為0.2-2毫克/毫升；所述可溶性鹽的濃度 優選為80-100毫摩爾/升，蛋白酶K的濃度優選為0.2-1毫克/毫升；所述預處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉；所述可溶性鹽溶液為NaCl水溶液。

4、根據權利要求1、2或3所述的試劑，其特徵在於：所述裂解結合液中，Chaotropic鹽的濃度為4-6M，緩衝鹽的濃度為50-120毫摩爾/升，螯合劑的濃度為20-80毫摩爾/升，表面活性劑的濃度為2-8％（體積百分比），兼性離子去污劑的濃度為1-3克/100毫升，醇的濃度為20-28％（體積百分含量）；所述裂解結合液中的表面活性劑優選用非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑為TritonX-100、Tween20、Tween21、Tween.40、Tween60、Tween80、Tween85、NP-40、Brij30或Span20；所述兼性離子去污劑是3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸；所述醇是乙醇、異丙醇或聚乙二醇。

5、根據權利要求1-4任一所述的試劑，其特徵在於：所述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度為4.2-5.8M，醇是30-45％（體積百分含量）的乙醇，螯合劑的濃度為20-80毫摩爾/升。

6、根據權利要求1-5任一所述的試劑，其特徵在於：所述洗滌液II優選為75％（體積百分比）乙醇水溶液。

7、根據權利要求1-6任一所述的試劑，其特徵在於：所述洗脫液中的Tris-HCl的濃度是10毫摩爾/升、EDTA的濃度是1毫摩爾/升，所述洗脫液pH為8.0。

8、根據權利要求1-7任一所述的試劑，其特徵在於：所述每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球為50毫克。

9、根據權利要求1-8任一所述的試劑，其特徵在於：在所述試劑盒中，所述緩衝鹽為Tris-HCl、磷酸鹽或HEPES鹽；所述螯合劑為檸檬酸鹽、EDTA、EGTA或CDTA；所述Chaotropic鹽為異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉或三氯醋酸鹽，所述Chaotropic鹽優選是異硫氰酸胍、硫氰酸胍或鹽酸胍，更優選是異硫氰酸胍。

10、權利要求1-9任一所述的試劑製成的試劑盒。

實施方式

• 實施例1 提取純化微量血液中的DNA以及效果驗證

一、提取純化微量血液中的DNA以及STR複合擴增分析

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10毫摩爾/升 Tris-HCl，0.5克/100毫升的十二烷基磺酸鈉（SDS），1毫摩爾/升的EDTA和50毫摩爾/升的NaCl水溶液，0.5毫克/毫升的蛋白酶K。

裂解結合液：pH為6.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：50毫摩爾/升的Tris-HCl，3M的異硫氰酸胍，1％（體積百分比）的TritonX-100，0.5克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），10毫摩爾/升的EDTA以及15％（體積百分含量）的乙醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4M的鹽酸胍，25％（體積百分含量）的乙醇和10毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：75％（體積百分含量）乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是10毫摩爾/升的Tris-HCl，1毫摩爾/升的EDTA。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是60納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為50毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

1）預處理

在1.5毫升離心管中首先加入100微升預處理裂解液，然後將0.1微升液態抗凝血加 入預處理裂解液中，渦旋振盪，56℃溫浴30分鐘。

充分振盪後，通過離心去除載體（指生物細胞所粘附或附著的固體物質），得到粗裂解液。

2）核酸吸附於固相載體

往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液（加入量為10微升濃度為50毫克/毫升的溶液）和300微升的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的複合體，該複合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。

3）複合體分離

將離心管漩渦振盪後，放於磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下，將步驟2）中的磁性納米微球-DNA的複合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分離出。

4）洗滌

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體；

往離心管中加入500微升洗滌液II，漩渦振盪洗滌後吸棄液體，重複該操作一次。

洗滌可以將結合在固相載體（磁性納米微球）上的核酸之外的物質去除。

5）洗脫

在洗滌結束後，用20微升槍頭吸乾殘留液體，室溫晾乾5-10分鐘（室溫超過30℃時，晾乾5分鐘即可；室溫低於30℃時晾乾7-10分鐘，但最多不可超過10分鐘）。然後往離心管中加入30微升的洗脫液，65℃溫浴5-8分鐘，磁分離，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

3、STR複合擴增分析

將實施例1提取的DNA進行STR複合擴增，複合擴增採用的是市售的商業STR複合擴增試劑盒（如美國ABI公司的Id試劑盒）。然後用3130型遺傳分析儀檢測，結果如圖1A所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。

二、提取純化微量血液中的DNA以及濃度檢測

1、提取DNA

從不同體積（1、2、3、4和5微升）的液態抗凝血中提取DNA。提取的方法與上述 步驟一相同，其區別在於所用試劑的量：

提取1、2、3、4微升液態抗凝血中的DNA的方法與上述步驟一相同，並且所用的預處理裂解液均是100微升；磁珠懸浮液均是10微升；裂解結合液均是300微升；洗滌液I均是500微升；洗滌液II均是500微升；洗脫液均是30微升。

提取5微升液態抗凝血中的DNA，所用的預處理裂解液200微升；磁珠懸浮液20微升；裂解結合液600微升；洗滌液I500微升；洗滌液II500微升；洗脫液50微升。

利用實時螢光定量PCR試劑盒（QuantiflerHuman，ABI公司）和螢光定量系統檢測所提取的DNA的濃度，結果如表1所示，該試劑盒整體提取效率高。

表1還顯示：採用兩種不同的定量方法（實時螢光定量PCR和染料定量），兩種方法定量結果相當，表明DNA完整性卓越，表明DNA在提取的過程中DNA斷裂極少。

表1.不同體積液態抗凝血中提取的DNA的濃度檢測結果

血液體積（微升）	DNA提取量（納克）		理論DNA量（納克）
	Quantifler Human	Qubit螢光定量
1	30.25	31.2	33
2	61.31	61.42	66
3	100.52	98.69	99
4	135.12	136.08	132
5	167.11	165.34	165

三、DNA提取效率評價

採用300納克DNA標準品（G1471，Promega公司）作為初始DNA（60微升），採用實施例1步驟一提供的試劑和方法進行提取，通過DNA螢光定量方法檢測出最終回收的DNA量，並按照公式【提取效率＝洗脫得到的DNA回收量（納克）/加入DNA標準品的量（300納克）】計算出DNA提取效率。

其中，螢光定量PCR的實驗設計如下：

1）配製7份含300納克DNA（30微升體系）的標準品，其中6份作為樣本，採用《提取純化DNA的試劑》的試劑和方法進行提取。餘下一份作為陽性對照，與其餘6份同樣的標準品在DNA提取後進行電泳比較；

2）為了便於比較，6個提取樣本仍然採用30微升體系洗脫；

3）在獲得6個30微升DNA樣本後，最終在每個30體系中同樣取20微升樣本，上 樣並進行電泳檢測。

電泳圖如圖1B（M為分子量Marker（λ/HindIIIDNA分子量Marker），其分子量範圍500bp-23kb；1-6為該專利提供試劑和方法提取得到的DNA（在30微升體系中取20微升電泳）；陽性對照為含有300納克DNA標準品（在30微升體系中取20微升電泳）所示，通過1-6號樣本和陽性對照的電泳結果比較，發現1-6號樣本在DNA電泳條帶的亮度、寬度和位置等方面與陽性對照樣本基本一致，表明在提取過程中DNA損失小，DNA提取效率高，所提取DNA完整性好。而且，DNA螢光定量結果表明該發明提供的試劑和方法DNA提取效率高於90％。

定量結果如表2所示，DNA提取效率高達93.67％。

表2.DNA提取效率

實驗分組編號（初始DNA的量300納克）	未吸附DNA（納克）	DNA吸附量（納克）	DNA回收量（納克）	DNA提取效率（％）
1	8	292	281	93.67
2	21	279	271	90.33
3	16	284	277	92.33
4	16	284	273	91.0
5	12	288	278	92.67
6	20	280	272	90.67

• 實施例2 提取純化血斑中的DNA以及效果驗證

將FTA卡上3×3毫米血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化血斑中的DNA

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為8.0，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：50毫摩爾/升Tris-HCl，3克/100毫升的十二烷基磺酸鈉（SDS），50毫摩爾/升的CDTA和100毫摩爾/升的NaCl水溶液，0.2毫克/毫升的蛋白酶K。

裂解結合液：pH為7.0，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：100毫摩爾/升的Tris-HCl，5M的異硫氰酸胍，5％（體積百分比）的TritonX-100，2克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），50毫摩爾/升的EDTA以及20％（體積百 分比）的乙醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：5M的鹽酸胍，35％（體積百分含量）的乙醇和50毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：75％（體積百分含量）乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是10毫摩爾/升的Tris-HCl，1毫摩爾/升的EDTA。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是200納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為50毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

1）預處理

在1.5毫升離心管中首先加入200微升預處理裂解液，然後將FTA卡上3×3毫米血斑加入預處理裂解液中，渦旋振盪，56℃溫浴30分鐘。

充分振盪後，通過離心去除載體（指生物細胞所粘附或附著的固體物質），得到粗裂解液。

2）核酸吸附於固相載體

往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液（加入量為20微升濃度為50毫克/毫升的溶液）和600微升的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的複合體，該複合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。

3）複合體分離

將離心管漩渦振盪後，放於磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下，將步驟2）中的磁性納米微球-DNA的複合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分離出。

4）洗滌

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體；重複該操作一次

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體，重複該操作一次。

洗滌可以將結合在固相載體（磁性納米微球）上的核酸之外的物質去除。

5）洗脫

在洗滌結束後，用20微升槍頭吸乾殘留液體，室溫晾乾5-10分鐘（室溫超過30℃時，晾乾5分鐘即可；室溫低於30℃時晾乾7-10分鐘，但最多不可超過10分鐘）。然後往離心管中加入50微升的洗脫液，65℃溫浴5-8分鐘，磁分離，吸取DNA，4℃或 -20℃保存。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖2所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。

• 實施例3 提取純化血斑中的DNA以及效果驗證

將2微升抗凝血滴在棉簽上的樣品作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：100毫摩爾/升磷酸鹽（100毫摩爾/升NaH₂PO₄，20毫摩爾/升NaCl，pH8.2），5.0克/100毫升的十二烷基肌氨酸鈉（SLS），100毫摩爾/升的EGTA和150毫摩爾/升的NaCl水溶液，5.0毫克/毫升的蛋白酶K。

裂解結合液：pH為7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：150毫摩爾/升的Tris-HCl，8M的硫氰酸胍，10％（體積百分比）的Tween20，4.0克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），100毫摩爾/升的EGTA以及30％（體積百分含量）的異丙醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：6M的硫氰酸胍，50％（體積百分含量）的乙醇和100毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：80％（體積百分含量）乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是20毫摩爾/升的Tris-HCl，2毫摩爾/升的EDTA。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是600納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為50毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

1）預處理

在1.5毫升離心管中首先加入200微升預處理裂解液，然後將滴在棉簽上的2微升液態抗凝血加入預處理裂解液中，渦旋振盪，56℃溫浴30分鐘。

充分振盪後，通過離心去除載體（指生物細胞所粘附或附著的固體物質），得到粗裂解液。

2）核酸吸附於固相載體

往步驟1）得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液（加入量為20微升濃度為50毫克/毫升的溶液）和600微升的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的複合體，該複合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。

3）複合體分離

將離心管漩渦振盪後，放於磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下，將步驟2）中的磁性納米微球-DNA的複合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分離出。

4）洗滌

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體；重複該操作一次

往離心管中加入500微升洗滌液II，漩渦振盪洗滌後吸棄液體，重複該操作一次。

洗滌可以將結合在固相載體（磁性納米微球）上的核酸之外的物質去除。

5）洗脫

在洗滌結束後，用20微升槍頭吸乾殘留液體，室溫晾乾5-10分鐘（室溫超過30℃時，晾乾5分鐘即可；室溫低於30℃時晾乾7-10分鐘，但最多不可超過10分鐘）。然後往離心管中加入50微升的洗脫液，65℃溫浴5-8分鐘，磁分離，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖3所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法能夠有效提取到載體表面所粘附細胞內的DNA，得到的DNA純度高，完整性好。

• 實施例4 提取純化血斑中的DNA以及效果驗證

將2微升抗凝血、PCR抑制劑滴在棉布上形成的血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA，其中，該抑制劑為1微升血紅素（0.5毫摩爾/升）和1微升腐殖酸（2.5毫克/毫升）組成的混合物。

一、提取純化DNA

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為7.7，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：30毫摩爾/升Tris-HCl，2.0克/100毫升的十二烷基肌氨酸鈉（SLS），30毫摩爾/升的EGTA和80毫摩爾/升的NaCl水溶液，2.0毫克/毫升的蛋白酶K。

裂解結合液：pH為7.1，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：80毫摩爾/升的Tris-HCl，4M的硫氰酸胍，2％（體積百分比）的Tween20，1.5克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），30毫摩爾/升的EGTA以及24％（體積百分含量）的異丙醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4.4M的鹽酸胍，30％（體積百分含量）的乙醇和30毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：80％（體積百分含量）乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是1毫摩爾/升的EDTA。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是1000納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為50毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

1）預處理

在1.5毫升離心管中首先加入200微升預處理裂解液，然後將該實施例的生物樣品加入預處理裂解液中，渦旋振盪，56℃溫浴30分鐘。

充分振盪後，通過離心去除載體（指生物細胞所粘附或附著的固體物質），得到粗裂解液。

2）核酸吸附於固相載體

往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液（加入量為20微升濃度為50毫克/毫升的溶液）和600微升的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的複合體，該複合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。

3）複合體分離

將離心管漩渦振盪後，放於磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下，將步驟2）中的磁性納米微球-DNA的複合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分離出。

4）洗滌

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體；重複該操作一次

往離心管中加入500微升洗滌液II，漩渦振盪洗滌後吸棄液體，重複該操作一次。

洗滌可以將結合在固相載體（磁性納米微球）上的核酸之外的物質去除。

5）洗脫

在洗滌結束後，用20微升槍頭吸乾殘留液體，室溫晾乾5-10分鐘（室溫超過30℃時，晾乾5分鐘即可；室溫低於30℃時晾乾7-10分鐘，但最多不可超過10分鐘）。然後往離心管中加入50微升的洗脫液，65℃溫浴5-8分鐘，磁分離，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖4所示，STR峰型較好，峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例5 提取純化血斑中的DNA以及效果驗證

將2微升抗凝血滴在牛仔褲上作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為8.3，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：70毫摩爾/升Tris-HCl，4克/100毫升的十二烷基肌氨酸鈉（SLS），70毫摩爾/升的EGTA和120毫摩爾/升的NaCl水溶液，4毫克/毫升的蛋白酶K。

裂解結合液：pH為7.3，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：120毫摩爾/升的Tris-HCl，6M的鹽酸胍，3％（體積百分含量）的Tween20，3克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），70毫摩爾/升的EGTA以及26％（體積百分含量）的聚乙二醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：5.6M的碘化鉀，45％（體積百分含量）的乙醇和70毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：75％（體積百分含量）乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是10毫摩爾/升的Tris-HCl。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是1200納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為50毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取純化DNA的方法與實施例3提供的方法的區別在於提取純化DNA的試劑不同，其餘完全相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖5所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例6 提取純化精斑中的DNA以及效果驗證

將1微升精液滴在無色棉布上作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

精斑的提取與常規檢材存在微小差異，即在預處理裂解液中需加入DTT（二硫蘇糖醇）才能正常提取。

一、提取純化DNA

1、試劑

試劑如下：

預處理裂解液：pH為7.6，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：90毫摩爾/升Tris-HCl，4.5克/100毫升的十二烷基磺酸鈉（SDS），6毫摩爾/升的EDTA和70毫摩爾/升的NaCl水溶液，1.0毫克/毫升的蛋白酶K，0.05MDTT（二硫蘇糖醇）。

裂解結合液：pH為7.2，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20毫摩爾/升的Tris-HCl，7M的硫氰酸胍，2.5％（體積百分比）的Tween21，1.0克/100毫升的3-（3-膽胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS），20毫摩爾/升的EGTA以及18％（體積百分含量）的異丙醇。

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4.6M的高氯酸鈉，40％（體積百分含量）的乙醇和15毫摩爾/升的EDTA。

洗滌液II：75％乙醇水溶液。

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是10毫摩爾/升的Tris-HCl，1毫摩爾/升的EDTA。

磁珠懸浮液：每毫升磁珠懸浮液中的納米級矽包被磁性微球（直徑是50納米）（奧潤微納新材料科技有限公司）為100毫克，其餘為水。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

1）預處理

在1.5毫升離心管中首先加入200微升預處理裂解液，然後將該實施例的生物樣品加入預處理裂解液中，渦旋振盪，56℃溫浴30分鐘。

充分振盪後，通過離心去除載體（指生物細胞所粘附或附著的固體物質），得到粗裂解液。

2）核酸吸附於固相載體

往步驟1）得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液（加入量為20微升濃度為100毫克/毫升的溶液）和600微升的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的複合體，該複合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。

3）複合體分離

將離心管漩渦振盪後，放於磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下，將步驟2）中的磁性納米微球-DNA的複合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分離出。

4）洗滌

往離心管中加入500微升洗滌液I，漩渦振盪洗滌後吸棄液體；重複該操作一次

往離心管中加入500微升洗滌液II，漩渦振盪洗滌後吸棄液體，重複該操作一次。

洗滌可以將結合在固相載體（磁性納米微球）上的核酸之外的物質去除。

5）洗脫

在洗滌結束後，用20微升槍頭吸乾殘留液體，室溫晾乾5-10分鐘（室溫超過30℃時，晾乾5分鐘即可；室溫低於30℃時晾乾7-10分鐘，但最多不可超過10分鐘）。然後往離心管中加入50微升的洗脫液，65℃溫浴5-8分鐘，磁分離，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法 相同，結果如圖6所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例7 提取純化唾液中的DNA以及效果驗證

將50微升唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例2的區別在於所述氯化鈉水溶液的濃度為130毫摩爾/升，其餘試劑完全相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

用步驟1的試劑提取純化DNA的步驟與實施例2提供的步驟以及所用的各試劑的量完全相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖7所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例8 提取純化菸蒂中的DNA以及效果驗證

將菸蒂作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例7的區別在於所用氯化鈉溶液的濃度為90毫摩爾/升，其餘試劑完全相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取方法與實施例7相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法 相同，結果如圖8所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例9 提取純化毛髮中的DNA以及效果驗證

將自然脫落的毛髮的毛根部分（總長度約為1-3毫米）作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

毛髮的提取與常規檢材還存在差異，即在預處理裂解液中需加入DTT（二硫蘇糖醇）才能正常提取。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例6的區別在於所用氯化鈉溶液的濃度為110毫摩爾/升，其餘試劑完全相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取步驟與實施例6相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖9所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例10 提取人體組織中的DNA以及效果驗證

將人體組織塊（1-2立方毫米肌肉組織）作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例7的區別在於所用氯化鈉溶液的濃度為140毫摩爾/升，其餘試劑完全相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取步驟與實施例7相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法 相同，結果如圖10所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例11 提取人體脫落細胞中的DNA以及效果驗證

將手機上的脫落細胞作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。其中，脫落細胞的獲取步驟包括以下步驟：用鑷子取少許棉簽（10-20毫克）浸濕後擦拭脫落細胞所在物體表面，隨後取少許乾燥棉簽（10-20毫克）重複擦拭濕潤表面，將兩粘附有脫落細胞的載體一併加入到預處理裂解液中，渦旋振盪。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例1相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取步驟與實施例2相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖11所示，STR峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例12-15

實施例12提取的是毛衣上的脫落細胞的DNA，實施例13提取的是錢包上脫落細胞的DNA，實施例14提取的是杯口脫落細胞的DNA，實施例15提取的是鍵盤脫落細胞的DNA。

實施例12-15中的脫落細胞的獲得方法、提取該脫落細胞的DNA所用的試劑和提取的方法與實施例11均相同，其STR複合擴增分析檢測結果如圖12、13、14和15所示，STR峰值較高，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好並具較好的完整性。

• 實施例16 腐敗生物樣品DNA提取結果

將3×3毫米的腐敗血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例1相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取步驟與實施例2相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖16所示，STR位點完整，無大片段位點丟失現象，分型準確，無等位基因丟失、Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，獲得了符合STR複合擴增要求的模板DNA

• 實施例17 腐敗生物樣品DNA提取結果

將1-2立方毫米的腐敗組織作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。

一、提取純化DNA

1、試劑

所用試劑與實施例1相同。

2、用步驟1的試劑提取純化DNA

提取步驟與實施例2相同。

二、STR複合擴增分析

將上述步驟得到的DNA進行STR複合擴增分析，其方法與實施例1提供的方法相同，結果如圖17所示，STR位點完整，無大片段STR位點丟失，分型準確，無Pullup峰、stutter帶、split峰等現象出現，表明該純化方法純化效率高，所得DNA純度高，該試劑能夠在腐敗生物樣本中純化得到相對完整的DNA片段。

榮譽表彰

2016年12月7日，《提取純化DNA的試劑》獲得第十八屆中國專利優秀獎。