抽提質粒DNA常用鹼裂解法，它是一種套用最為廣泛的製備質粒DNA的方法，其基本原理為：在鹼性條件（pH12.5）下，線性染色體DNA的雙螺旋結構解開而變性，質粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補鏈彼此纏繞，緊密結合在一起。當加入乙酸鉀恢復至中性時，染色體DNA分子難以復性，而質粒DNA分子很快復性，離心時，染色體DNA與細胞碎片一起被沉澱出來，而質粒DNA則留在上清液中，用異丙醇或乙醇沉澱後洗滌、可得到較純的質粒DNA。鹼裂解法通常有大量提取法和小量提取法，其提取原理是一樣的，只需體積按一定比例擴大。
純化質粒DNA時通常還利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。開始進行克隆時，對於小量製備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉澱等簡單步驟去除殘餘蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。要使用特殊純化的質粒時，可採用氯化銫方法抽提，但該方法比較複雜，對技術要求高，花費時間長，也比較昂貴。
基本介紹
- 中文名：鹼裂解法
- 所屬學科：生物學
- 關聯詞條：質粒抽提
注意事項,常見問題,
注意事項
（1）嚴格控制鹼變性的時間，不超過5min。因為，如果質粒處於強鹼性環境中的時間過長，可發生不可逆變性，導致限制性內切酶切割困難。
（2）在加入溶液Ⅲ後，要充分混勻並置冰上。如未見大量白色沉澱，說明實驗失敗，應立即重做。
（3）棄上清時，必須控乾即除儘管內的液體，在做最後一步時，應儘量將乙醇揮發乾淨，因為如殘留較多乙醇，以後在做酶切鑑定時，乙醇會使限制性內切酶失活。但此步的時間不宜過長，一般在10~15min，可用濾紙條小心吸淨離心管壁上的乙醇液滴以節省時間。
常見問題
1．未提到質粒或質粒得率較低
（1）大腸桿菌老化
塗布平板培養後，重新挑選新菌落進行液體培養。
（2）質粒拷貝數低
由於使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。
（3）菌體中無質粒
有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接後有可能造成質粒丟失，因此，不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
（4）鹼裂解不充分
使用過多的菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助於增加質粒提取量和質粒質量。
（5）溶液使用不當
溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置於37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液才能使用。
（6）吸附柱過載
不同產品中吸附柱的吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液的體積。
（7）質粒未全部溶解
尤其是質粒較大時，洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
（8）乙醇殘留
漂洗液洗滌後應離心，儘量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗後應晾乾樹脂，再加入洗脫緩衝液。
（9）洗脫液加入位置不正確
洗脫液應加在矽膠膜的中心部位，以確保洗脫液會完全覆蓋矽膠膜的表面，達到最大洗脫效率。
（10）洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩衝液EB（10mmol/L Tris·Cl，pH8.5）或水。洗脫效率取決於pH。最大洗脫效率在pH7.0~8.5間。當用水洗脫時，確保其pH在此範圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩衝液加熱至60℃後使用，有利於提高洗脫效率。
（11）洗脫體積太小
洗脫體積對回收率有一定的影響。隨著洗脫體積的增大，回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率，可以增大洗脫體積。
（12）洗脫時間過短
洗脫時間對回收率也會有一定的影響。洗脫時放置1min可達到較好的效果。
2．質粒純度不高
（1）混有蛋白質
不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理並離心後，溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白質懸浮物，可再次離心去除後再進行下一步驟。
（2）混有RNA
RNaseA處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之後室溫放置一段時間。如果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNaseA。
（3）混有基因組DNA
加入溶液P2和P3後應溫和混勻，如果劇烈振盪，可能把基因組DNA剪下成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液P2後過於黏稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，不要超過16h。
（4）P3溶液加入時間過長
P3溶液加入後，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。
（5）含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。
（6）裂解時間過長
加入溶液P2後裂解時間不應超過5min。
（7）質粒的二聚體和多聚體形式
是質粒複製過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。
3．加入溶液Ⅱ後，菌液仍然呈渾濁狀態，或者渾濁度沒有明顯的改變
這說明細菌裂解不完全，主要原因如下。
①溶液Ⅱ失效：首先看看10% SDS是否是澄清的，NaOH是否是有效的。
②可能是細菌濃度很高，適當調整增加溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的體積。
③可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異常快，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現為與目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產物不是自己想要的質粒，應特別注意。
4．電泳點樣孔中有亮帶
質粒中污染了細菌基因組DNA，多是由於加入溶液Ⅱ後震盪過於劇烈造成細菌基因組剪下或放置時間過長等引起。因此加溶液Ⅱ後應溫和震盪，絕不能渦旋震盪，並且冰浴放置時間要短於5min。
