基本介紹
- 中文名：DNA提取試劑盒
- 外文名：DNA Extraction Kit
- 套用領域：醫學
保存方式,操作方法,分類,
保存方式
室溫。低溫保存可能會有沉澱析出。如果發生析出現象，請於50℃溶解後，再於室溫保存。
操作方法
全套操作約需1小時，分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細說明如下。
勻漿和細胞裂解:
使用不同的實驗材料需採用不同的勻漿步驟，具體說明如下：
【從動物組織中提取基因組DNA】
使用研缽進行勻漿時：
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。
注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。
B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C．富含角質蛋白的組織或堅硬的組織（如骨骼）等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。
注）使用上述①-注）的實驗材料時，請在加入Solution A及RNase A1後，將研缽置於65℃水浴上研磨1分鐘。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。
使用研磨棒進行勻漿時:
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1後用研磨棒快速研磨成勻漿。
③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振盪混合後，65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養細胞中提取基因組DNA】
植物材料種類
植物材料使用量*
植物花、葉片
10～100 mg
植物莖
60～240 mg
植物根
80～240 mg
植物種子
80～240 mg
* 如選取植物的根、種子等樣品時，因其基因組DNA含量很低，需使用超過表格中所示的參數用量，此時請分兩管進行步驟1～6的實驗操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾，使各管的基因組DNA結合到同一個Spin Column上。
注）樣品研磨應充分，否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。
② 將研缽移至65℃水浴，當樣品粉末剛開始融化時，向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。
注）處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含澱粉、蛋白質的種子等時，可延長水浴時間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
① 取10～250 μl的全血（含抗凝劑）加入至Collection Tube中。
② 加入500 μl的Solution A。
③ 加入1 μl的RNase A1，激烈振盪15秒鐘後，冰浴5分鐘。
注） 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl；禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。
【從培養細胞中提取基因組DNA】
三.使用懸浮培養的動物細胞時：
① 使用Collection Tube收集1×105～1.5×107的細胞懸浮液，5,000 rpm離心5分鐘，棄上清（細胞培養液）。
③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1，激烈振盪15秒鐘，然後室溫靜置1分鐘。
四.使用貼壁細胞時：
① 棄盡培養液，向培養皿中加入650 μl的Solution A，室溫靜置1分鐘。
注）96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時，請分數次處理細胞。
③ 加入0.8 μl的RNase A1，激烈振盪15秒鐘，然後室溫靜置1分鐘。
2. 加入400 μl的Solution B，振盪混合。
3. 加入1 ml的4℃預冷的Solution C，充分混勻後，12,000 rpm離心2分鐘。
4. 棄去上層有機相，再加入1 ml的4℃預冷的Solution C，充分混勻後，12,000 rpm離心2分鐘。
5. 棄去上層有機相，然後將水相溶液（無色下層）轉移至置於Collection Tube上的Filter Cup中，12,000 rpm離心1分鐘。
注）有機相（上層）帶有顏色，請務必除盡，否則會阻礙DNA結合到DNA製備膜上。相間沉澱不必考慮，在過濾時將被去除。
6. 棄Filter Cup，在濾液中加入400 μl的DB Buffer，混合均勻。
7. 將試劑盒中的Spin Column安置於Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。
8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
注）請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助於完全沖洗沾附於管壁上的鹽份。
10. 重複操作步驟9。
11. 將Spin Column安置於新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50～200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利於提高洗脫效率。
12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。
如果實驗室備有適合於Spin Column接口的負壓裝置，可從上述操作步驟6完成以後進行以下操作。
7. 將試劑盒中的Spin Column插到負壓裝置的插口上，將上述操作步驟6的混合溶液轉移到Spin Column中，開啟調節負壓裝置，緩慢吸走Spin Column中的溶液（流速控制在1滴/秒）。
8. 將負壓調至最大，向Spin Column中加入500 μl的Rinse A，吸盡Spin Column中溶液。
9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B，吸盡Spin Column中溶液。
注）請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助於完全沖洗沾附於管壁上的鹽份。
10. 重複操作步驟9。然後從負壓裝置上取下Spin Column，將其安置於試劑盒中的Collection Tube上，12, 000 rpm離心1分鐘。
11. 將Spin Column安置於新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50～200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利於提高洗脫效率。
12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。
