密度梯度離心

密度梯度離心（density gradient centrifugation）

用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置於介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求：1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。

基本介紹

• 中文名：密度梯度離心
• 外文名：density gradient centrifugation
• 簡稱：區帶離心法
• 缺點：離心時間較長；不易掌握等

密度梯度離心原理

不同顆粒之間存在沉降係數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。

密度梯度離心法

密度梯度離心法 density gradient centrifugation method

密度梯度區帶離心法（簡稱區帶離心法）：
區帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。此法的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應範圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降係數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆粒活性，並防止已形成的區帶由於對流而引起混合。
此法的缺點是：①離心時間較長；②需要製備惰性梯度介質溶液；③操作嚴格，不易掌握。
密度梯度區帶離心法又可分為兩種：
（1）差速區帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降係數差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質的不同區域上形成區帶的方法稱為差速區帶離心法。此法僅用於分離有一定沉降係數差的顆粒（20% 的沉降係數差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質，與顆粒的密度無關，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質溶液，樣品液加在梯度介質的液面上，離心時，由於離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間後，沉降的顆粒逐漸分開，最後形成一系列界面清楚的不連續區帶，沉降係數越大，往下沉降越快，所呈現的區帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結束，樣品顆粒的密度要大於梯度介質的密度。梯度介質通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達1.28 g/cm3和60%。
此離心法的關鍵是選擇合適的離心轉速和時間
（2）等密度區帶離心法：離心管中預先放置好梯度介質，樣品加在梯度液面上，或樣品預先與梯度介質溶液混合後裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預形成梯度和離心形成梯度的等密度區帶離心產生梯度的二種方式。
離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區帶，這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態後，再延長離心時間和提高轉速已無意義，處於等密度點上的樣品顆粒的區帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉速可以縮短達到平衡的時間，離心所需時間以最小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數日。
等密度離心法的分離效率取決於樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關，但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區頻寬度。
等密度區帶離心法所用的梯度介質通常為氯化銫CSCl，其密度可達1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離複合蛋白質，但簡單蛋白質不適用。